采用分型方法检测溯源副溶血性弧菌分析

邵守峰 吴学香

【摘要】目的：采用分型法对副溶血性弧菌进行分析，追溯亲缘关系。方法：共收集1087株副溶血性弧菌，实施血清分型，同时利用脉冲场电泳基因分析以及肠杆菌基因间重复序列分析追踪感染源，了解亲缘关系。结果：来自食物的607例可分为10个血清群，其中0：6血清群最多，占比16.46%，来自病人的480例可分为6个血清群，其中0：3血清群最多，占比72.92%；食品中的377株VP可分为PFGE型25个，病人501株可分为19个，其中最多的为1型（P<0.05）；所有菌株可分为ERIC型42个，其中最多的为18型。结论：不同分型方法在副溶血性弧菌分型中均具有优缺点，多种分型方法联合使用可在很大程度上提升分型有效性。

【关键词】分型法；溯源；副溶血性弧菌

[中图分类号]R446.5 [文献标识码]A [文章编号]2096-5249（2021）03-0001-03

Detection of Vibrio parahaemolyticus by typing

SHAO Shou-feng 1， WU Xue-xiang 2（1. Center for Disease Control and prevention， Huangdao District， Qingdao Shandong 266400， China； 2. Liuwang Central Health Center， Huangdao District， Qingdao Shandong 266400， China）

[Abstract] Objective： To analyze Vibrio parahaemolyticus withtyping method and trace the genetic relationship. Methods： A total of 1087 strains of Vibrio parahaemolyticus were collected and serotyped. Then， pulse field electrophoresis gene analysis and intergenic repeat sequence analysis of enterobacter were used to trace the source of infection and understand the genetic relationship. Results： 607 cases from food can be divided into 10 serogroups， of which 0：6 serogroups is the most， accounting for 16.46%， and 480 cases from patients can be divided into 6 serogroups， of which 0：3 serogroups is the most， accounting for 72.92 %； The 377 strains of Vibrio parahaemolyticus in food can be divided into 25 PFGE types， and the 501 strains of patients can be divided into 19 PFGE types， of which the most is type 1（P<0.05）； All strains can be divided into 42 ERIC types， the most of which is type 18. Conclusion： Different typing methods have their own advantages and disadvantages in the typing of Vibrio parahaemolyticus， and the combined use of multiple typing methods can improve the effectiveness of typing greatly.

[Key words] typing method； look for the roots； Vibrio parahaemolyticus

副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus，VP）存在于某些食品之中，会造成人员由于食用了直接或间接被本菌污染的食品而引起急性胃肠炎，与多数食品中毒事件息息相关，是食品安全检查的重点内容[1]。本文对所采集的病株实施血清分型，另用多种方法实施溯源检测，以期了解菌株流行趋势以及方法可行性，实现副溶血性弧菌感染的减少和有效防控，研究结果如下。

1 资料与方法

1.1菌株来源 收集食品来源副溶血性弧菌计607株，收集病人及食物中毒副溶血性弧菌计480株，共收集1087株，将所有菌株实施血清分型，同时利用脉冲场电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）基因分析以及肠杆菌基因间重复序列（ERIC-PCR）分析追踪感染源，了解亲缘关系。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂TCBS琼脂 （生产企业：上海恒远生物科技有限公司）；弧菌显色培养基（生产企业：广东环凯微生物科技有限公司）；蛋白酶K（生产企业：洛阳惠尔纳米科技有限公司）；XbaⅠ酶（生产企业：宝生物工程（大连）有限公司）；API20E生化鉴定试剂条（生产企业：法国生物梅里埃股份有限公司）；营养琼脂培养基（生产企业：北京鸿润宝顺科技有限公司）；APW（碱性蛋白胨水）培养基（生产企业：上海广锐生物科技有限公司）；低熔点琼脂糖（生产企业：北京金泰宏达生物科技有限公司）；PFGE專用琼脂糖（生产企业：伯乐生命医学产品（上海）有限公司）。

1.2.2仪器脉冲场电泳系统 （品牌：伯乐bio-rad；型号：CHEF Mapper XA）；凝胶成像系统（品牌：伯乐biorad；型号：Versa Doc）。

1.3方法

1.3.1菌株分离鉴定 ①分离：使用筛检法对食品来源副溶血性弧菌实施分离；使用文献法对病人副溶血性弧菌实施分离。②鉴定：6%碱性蛋白胨水、蔗糖、阿拉伯胶糖、葡萄糖（产气）为可疑菌株复筛试剂，若出现6%碱性蛋白胨水、蔗糖阴性、阿拉伯胶糖阳性以及葡萄糖不产气等菌株则需要使用API20E生化鉴定试剂条进行进一步鉴定。

1.3.2分群 使用生理盐水清洗纯培养物（1%NaCl营养琼脂所得），后将其置于沸水中，时长控制在20min左右以破坏K抗原，离心处理后制成菌悬液，与VP“O”群分群血清完成作玻片凝集试验。

1.3.3分型 PFGE分型：①将新鲜培养物置于2mL细胞悬浮液，透射值为20%，后于离心管中置入200μL菌悬液，水浴，温度为37℃，时长为5min；将10μL蛋白酶K置于混合物中，水浴，温度为50℃，时长为10min；将1%金琼脂糖与菌悬液1：1混合，倒入模具，置于4℃下进行冷却，制成胶块；②将15μL蛋白酶K置于3mL细胞裂解液，取出胶块置于细胞裂解液中，水浴，温度为54℃，时长为2h，弃液，加入5mL纯水，水温50℃，使用50℃TE缓冲液清洗胶块，15min/次，共4次，在凉至室温后加入TE缓冲液3mL，于4℃下保存；③150μL酶切体系中置入3mm胶块，37℃过夜；④酶切样品置于模具，取1g金琼脂糖与0.5%TBE缓冲液加热溶解，在温度将至60℃后倒入模具，冷却后取出胶块，放于0.5%TBE缓冲液电泳槽；⑤实施电泳，时间设置为19h，脉冲参数为（2～10s；13h）：（20～25s；6h），电压每厘米6V，温度14℃；⑥电泳后取出凝胶，使用Goldview染色，时间为30min，后去离子水脱色，时间为30min；⑦用凝胶成像仪进行读胶；⑧结果判定。

ERIC-PCR分型：①制備PCR模板，于营养琼脂中培养VP，将培养物置于TNE缓冲液，加入0.5%十二烷基磺酸钠以及100μL蛋白酶K，水浴，温度为55℃，时长为30min，以1：24：25的比例抽取异戊醇、氯仿以及酚DNA，异丙醇沉淀，使用70%乙醇洗涤，后使用TE缓冲液溶解；②ERIC-PCR分型；③结果判定。

1.4统计学方法 数据分析软件选择为SPSS19.0，软件中

_x±s表示计量资料，对比使用t检验，例（%）则表示计数资料，对比使用χ2检验，若最终得出P<0.05则表示数据差异具有统计学意义。

2 结果

2.1血清分型结果 对所有1087株副溶血性弧菌实施血清分型，其中来自食物的607例可分为10个血清群，其中存在30株无法实施分型，最终分型率为95.06%，其中0：6血清群最多，占比16.46%；来自病人的480例可分为6个血清群，其中0：3血清群最多，占比72.92%，为流行优势血清群，详细信息见表1。

2.2 PFGE分型结果 878株副溶血性弧菌，在PFGE分型步骤完成后其菌株DNA分离情况较佳，具体可分为15～20个条带，其分子量则在20～700kb范围内。聚类分析结果显示，食品中的377株VP可分为PFGE型25个，病人501株VP可分为PFGE型19个，其中最多的为1型，与其他分型比差异明显（P<0.05）。

2.3 ERIC-PCR分型结果 261株副溶血性弧菌，其中来自食物141株，来自病人60株，多为食物中毒病人，且菌株经聚类分析，结果显示，所有菌株可分为ERIC型42个，其中最多的为18型。

3 讨论

副溶血性弧菌与流行性胃肠道疾病的发生有极强的关联性，流行度高，蔓延性强，也是造成食物中毒的关键病株，因此在食品安全检查中为必检项目，且食品来源病株与病人来源病株的分离存在一定差异，其致病风险还需要相关部门和人员实施进一步验证[2]。此次研究最终分型率为95.06%，存在30株无法实施分型，这可能是出现了新的血清群，目前无法将其归类，因此也说明副溶血性弧菌分型存在一定局限。PFGE 分型主要是是通过电场方向的改变对DNA进行有效分析，具有稳定性高、准确性强的优势，即使是菌株间的细小差异也可以进行清晰显示[3]。ERIC-PCR 分型则是利用弧菌属细菌以及肠杆菌科与菌种中的短重复序列不同进行菌株分析，分型有效率高，且在溯源方面优势明显，因此更能分析出菌株与致病因间的联系。

无论是血清分型、PFGE分型亦或是ERIC-PCR分型均可适用于副溶血性弧菌分型分析，但是其中优缺点也极为明显。首先，血清分型采用的是通过血清分型探析病株流行趋势进而实施溯源，但是该分型方式主要为表型特征的显示，重复性不强，可靠性不高，且操作较为复杂，分型率不高，无法有效应用于传染源追踪[4]。另外，菌株较易受到环境影响，一旦出现新血清型就难以分辨，给流行病学调查造成阻碍，因此血清分型在追踪传染源方面制约性强，且无法有效对暴发性感染菌株特征加以确定，因此在副溶血性弧菌分型分析中不甚理想。PFGE分型以及ERIC-PCR分型则是直接从DNA入手对副溶血性弧菌实施分型，在分型效果上具有特异性、敏感性强，分辨率、分型率高的优势，这主要是因为DNA所传达的遗传信息差异直接决定异种生物、同种生物不同株系的不同，因此成为了现代分型极为重要的手段。就优势而言，与血清分型、核糖体分型、生化分型等方式相比，PFGE分型及ERIC-PCR分型可重复性强，且操作便捷，分辨率高，更加适用于大样本检测。后两者相比，ERIC-PCR分型的操作便捷性优于PFGE，但是需要自行建立分型标准数据库，难度较大，而PFGE分型数据库已经存在，因此实用性更强。若想有效实现分型率的提高，相关工作人员以及部门不仅需要健全操作规程，还要重视与国内外有关企业和部门的合作，实现数据共享，共同建立准确率高、专业性强的基因分型数据库，共同推动副溶血性弧菌流行病学发展[5]。有研究表明，在进行副溶血性弧菌分型时综合使用多种分型法可以有效提高分型准确率和速度，进而为食物中毒事件的防控制定及时有效的预防方案。

综上所述，不同分型方法在副溶血性弧菌分型中均具有优缺点，多种分型方法联合使用可在很大程度上提升分型有效性，因此相关工作者要探求与实际需求相契的有效分型方法，为副溶血性弧菌所致植物中毒防控方案的制定提供科学依据。

参考文献

[1] 谢艺红， 姚雪婷， 苏奕成， 等. 2017年广西壮族自治区5个城市贝类海产品致病性弧菌污染状况分析[J]. 中国食品卫生杂志， 2020， 32（3）： 271-275.

[2] 陈伟冰， 李柏生， 卢向明， 等. 2012-2018年茂名市食品中食源性致病菌污染监测结果分析[J]. 应用预防医学， 2020， 26（2）： 150-152.

[3] 林才云， 江艳华， 姚琳， 等. 信号分子AI-2的体外合成及其对副溶血性弧菌四环素耐药性的调控作用[J]. 微生物学通报， 2020， 47（5）： 1321-1331.

[4] 宋晓昀， 王晔茹， 国琳， 等. 快速微生物定量风险评估工具及其改进在海产品中副溶血性弧菌风险分级中应用[J]. 中国食品卫生杂志， 2020， 32（1）： 83-87.

[5] 许金凤， 曹文婷， 张潇丹， 等. 镇江地区2018年不同来源副溶血性弧菌毒力基因及耐药性分析[J]. 临床检验杂志， 2020， 38（1）： 70-72.