基于网络药理学分析“附子-白术”药对治疗乳腺癌骨转移的作用机制

赖琦 谢丹 刘乐玲 邓韫洁 叶甜婧

摘要 目的：基于網络药理学分析“附子-白术”治疗乳腺癌骨转移的作用机制。方法：利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库并结合文献筛选附子和白术的活性成分，使用TCMSP及Swiss Target Prediction数据库预测作用靶点，通过GeneCards数据库收集乳腺癌骨转移的治疗靶点，绘制韦恩图获取药物疾病共同靶点，并导入Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-疾病-靶点”网络。利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，同时利用R软件进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析。结果：“附子-白术”通过25个活性成分作用于205个乳腺癌骨转移治疗靶点。主要通过9种核心活性成分，作用于AKT1、IL6、MAPK3等30个核心靶点，调控雌激素、破骨细胞分化、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信号通路，发挥治疗乳腺癌骨转移的作用。结论：“附子-白术”通过多成分、多靶点、多通路来调控乳腺肿瘤增殖、凋亡、转移并减轻骨破坏、骨痛。

关键词 附子;白术;乳腺癌骨转移;网络药理学;中药;靶点;通路;机制

Analysis of the Mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” Medicine

on Bone Metastasis of Breast Cancer Based on Network Pharmacology

LAI Qi1，XIE Dan2，LIU Leling1，DENG Yunjie1，YE Tianjing1

（1 The First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China;

2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China）

Abstract Objective：To analyze the mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” treatment of breast cancer bone metastasis based on network pharmacology.Methods：TCMSP database and literature were used to screen the active ingredients of Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae.TCMSP and Swiss Target Prediction database were used to predict the action target，and the therapeutic target of breast cancer bone metastasis was collected through GeneCards database.Venn diagram was draw to obtain the common target of drug disease，and Cytoscape 3.7.1 software was constructed to construct “drug-component-disease-Target” network.The STRING database was used to construct the protein interaction network，and the R software was used for GO and KEGG enrichment analysis.Results：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” acted on 205 breast cancer bone metastasis treatment targets through 25 active ingredients.It was mainly through 9 core active ingredients to act on 30 core targets such as AKT1，IL6，MAPK3，regulating signal pathways such as estrogen，osteoclast differentiation，PI3K-AKT，HIF-1，MAPK function etc.Conclusion：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” regulates breast tumor proliferation，apoptosis，metastasis and relieves bone destruction and bone pain through multiple components，multiple targets，and multiple pathways.

Keywords Radix Aconiti Lateralis Preparata; Rhizoma Atractylodis Macrocephalae; Bone metastasis of breast cancer; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine; Target; Pathway; Mechanism

中图分类号：R285;R273文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.015

乳腺癌发病率居女性恶性肿瘤的首位[1]，乳腺癌骨转移在晚期乳腺癌中的发生率为65%～75%，而首发症状为骨转移者占27%～50%，多为多发性溶骨性病变，常引起骨痛、骨损伤、骨相关事件影响患者生命质量[2]，乳腺癌患者确诊骨转移后的5年生存率仅20%～30%[3]。目前，针对乳腺癌骨转移的治疗方法主要包括放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗、手术治疗、双膦酸盐治疗及镇痛等支持疗法[2]，但临床疗效较低，并发症发生率较高，近年来，中医药治疗乳腺癌的效果让越来越多的患者对中国传统医药有了极大的信任，并且大多数患者都积极接受中医药治疗[4-5]。

乳腺癌骨转移在中医学属“骨痹”“骨瘤”“骨蚀”范畴。《医经精义》曰“肾藏精，精生髓，髓生骨，故骨者肾之所合也”;《素问·五脏生成篇》曰“肾之合骨也，其荣在发，其主脾也”;《景岳全书》曰“脾肾不足及虚弱失调之人，多有积聚之病”。中医认为肾为先天之本，主骨生髓，脾为后天之本，充养骨髓。相关文献对乳腺癌骨转移的中医证型分布进行统计，毛丹等[6]对110例患者进行分析，发现阳虚寒凝证型最多;许秋琳等[7]对236例患者进行分析，发现肝肾阴虚证组合多（38.13%），其次为脾肾阳虚证组合（35.17%）。因此脾肾阳虚为乳腺癌骨转移发生的重要病机，中医治法以温补脾肾为主。

附子辛、甘、大热，入心、肾、脾经，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效;白术苦、甘、温，入脾、胃经，具有健脾益气、燥湿利水等功效。“附子-白术”是补火温中的常用药对，源于白术附子汤、附子理中丸、实脾饮、真武汤等，其中白术附子汤出自《金匮要略》是治疗“骨痹”的代表方剂。临床研究证实白术附子汤用于治疗乳腺癌骨转移，在减轻疼痛、提高生命质量方面具有一定优势，还可以缓解因口服阿片类止痛药物导致的便秘，且安全性高[8-10]。现代药理学通过动物实验表明“附子-白术”是白术附子汤的核心药物，并且其通过减少破骨细胞的数量并抑制其活性、下调乳腺癌骨轉移组织中骨破坏因子、减少炎症介质并上调抑炎因子等发挥作用[11-15]。网络药理学能对药物-组成-靶点-信号通路的复杂关系进行分析，在现代药理学研究的基础上指导新药研发和药理作用研究的新兴学科[16]。“附子-白术”对乳腺癌骨转移的分子生物研究较多地停留在动物指标，因此我们采用网络药理学的方法对“附子-白术”药对治疗乳腺癌骨转移的药理机制进行了系统探讨，以期为该药对在临床使用及实验研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 “附子-白术”药对活性成分及作用靶点的获取

在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分别检索附子、白术的成分，根据药物吸收、分布、代谢及排泄特性，将口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18作为筛选标准[17]，满足条件的作为活性成分，并结合文献[18-19]补充药对的活性成分。利用PubChem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取活性成分的SMILES表达式。通过TCMSP可检索部分活性成分对应的靶蛋白，利用Swiss Target Prediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）检索活性成分的SMILES式以补充药物的靶蛋白，将两数据库的靶点信息进行整合去重。再将靶蛋白信息输入Uniprot数据库（http：//www.uni-prot.org/），限定物种为“Human”，使靶蛋白统一转换为药物作用的靶基因，即得到“附子-白术”药对的作用靶点。

1.2 乳腺癌骨转移治疗靶点的获取

使用GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）以“breast cancer with bone metastasis”为关键词进行检索，获得疾病治疗靶点。

1.3 药物与疾病共同靶点的筛选

在Venny2.1在线软件作图工具平台上分别录入白术、附子与乳腺癌骨转移的靶点，绘制韦恩图，得到“药物-疾病”的共同靶点。

1.4 网络模型的构建及分析

将药物活性成分、药物与疾病的共同靶点导入Cytoscape3.7.1软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络图，使用Network Analyzer对“附子-白术”的主要活性成分进行分析。

1.5 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络图

将上述药物-疾病共同靶点输入到STRING数据库（https：//string-db.org/），限定物种为人类，并选取minimum required interaction score>0.4，获取PPI网络关系数据，将其导入Cytoscape软件，绘制PPI网络。

1.6 通路富集分析

在R软件安装Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将药物与疾病共同靶点转换成entrezID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05，Q<0.05分析关键靶基因的功能与信号通路即基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）功能富集分析，并将结果以条形图形式输出。

2 结果

2.1 “附子-白术”活性成分及作用靶点

从TCMSP数据库获得附子活性成分21个、白术活性成分7个，结合文献补充纳入白术中的白术内酯（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、苍术酮、β-桉油醇、α-桉叶醇，附子中的乌头碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头原碱、宋果灵、易混翠雀花碱、尼奥灵、苯甲酰新乌头原碱、9-去羟基森布星，最终获得附子活性成分29个、白术活性成分13个，共42个。从TCMSP及Swiss Target Prediction数据库获得附子靶点152个、白术靶点176个，去除重复靶点，得到“附子-白术”作用靶点294个。见图1。

2.2 “附子-白术”与乳腺癌骨转移的共同靶点

在GeneCards数据库检索乳腺癌骨转移，共获得疾病靶点6 786个。输入176个白术靶点、152个附子靶点、6 786个疾病靶点，绘制韦恩图，取交集后获得药物-疾病共同靶点205个。见图2。即“附子-白术”治疗乳腺癌骨转移靶点。

2.3 “药物-成分-疾病-靶点”网络的构建与分析

将“附子-白术”中42个潜在活性成分与205个药物与疾病相同靶点导入Cytoscape中，获取“药物-

成分-靶点-疾病”网络图。见图3。图中紫色代表药物，蓝色代表中药复方中的25种活性成分（17个活性成分靶点与疾病靶点无交集，给予删除），绿色代表205个共同靶点，红色代表疾病，连线代表其相互关联。并通过Network Analyzer工具分析网络中活性成分的度值（Degree），度值越大说明该活性成分与作用靶点的关联个数越多，该成分越重要。结果显示，每个活性成分平均与17.84个靶点互相作用，度值大于20的活性成分有9个，其中α-香树精（Alpha-Amyrin）与53个靶点关联，α-桉叶醇（Alpha-Eudesmol）与50个靶点关联，准噶尔乌头碱（Songorine）与42个靶点关联，β-谷甾醇（3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R）-10，13-dimethyl-17-[（2R，5S）-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol）与39个靶点关联，白术内酯Ⅱ（AtractylenolideⅡ）与35个靶点关联，苯甲酰新乌头原碱（Benzoylhypaconine）与33个靶点关联，8β-乙氧基白术内酯Ⅲ（8beta-ethoxy atractylenolide Ⅲ）与29个靶点关联，白术内酯Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ）与26个靶点关联，白术内酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）與21个靶点关联，因此这9种活性成分可能是该药对起到治疗乳腺癌骨转移作用的核心成分。

2.4 PPI网络与分析

将上述205个共同靶点输入STRING数据库，再导入Cytoscape软件分析得到PPI网络。见图4。图中圆形节点代表靶点，连线代表靶点与靶点之间的联系，节点的大小、颜色及其深浅变化代表Degree值的大小，靶点Degree值越大表示该靶点与其他靶点的关联性越强，并根据Degree值筛选出核心靶点。将Degree值前30作为核心靶点。见图5。图中纵坐标代表靶点，横坐标表示Degree值。

2.5 通路富集分析

205个共同靶点经R语言进行GO和KEGG富集分析，将排前20的结果以条形图输出，图中P值代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。GO富集分析以生物学过程、细胞组分及分子功能为主。见图6～8。其中，交集基因集合共富集至1 919条生物学过程通路中，主要包括调节循环系统血管管径、激活蛋白激酶等;交集基因集合共富集至74条细胞组分表达过程中，主要涉及细胞膜的膜筏、突触膜及神经元细胞体等;交集基因集合共富集至183个与分子功能相关的过程中，主要涵盖调控类固醇激素受体、核受体、转录因子、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性并参与激素结合等。

KEGG功能富集共得到130条信号通路，前20的结果形成KEGG功能富集的条形图。见图9。结果显示共同靶点主要富集于肿瘤、糖尿病等多种疾病，与乳腺癌骨转移相关的通路主要有雌激素信号通路、破骨细胞分化、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等。

3 讨论

研究证实白术附子汤对乳腺癌骨转移患者疗效确切且“附子-白术”是该方的核心药物。本研究采用网络药理学的方法对“附子-白术”治疗乳腺癌骨转移的活性成分、作用靶点、相关生物信号通路进行了探讨。

3.1 “附子-白术”治疗乳腺癌骨转移核心活性成分分析

本研究获得25个“附子-白术”治疗乳腺癌骨转移的活性成分，并根据药物、成分、疾病、靶点相互作用的网络图，计算活性成分度值，得到9种核心活性成分，依次为α-香树精、α-桉叶醇、准噶尔乌头碱、β-谷甾醇、白术内酯Ⅱ、苯甲酰新乌头原碱、8β-乙氧基白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅲ、白术内酯Ⅰ。研究表明，苯甲酰新乌头原碱不仅能诱导实体瘤凋亡如胶质瘤、胃癌、肝癌等，还能促进血液肿瘤凋亡[20-21]。准噶尔乌头碱属于C-20二萜型附子生物碱，张亚平等[22]发现附子生物碱可减少小鼠乳腺癌发生率，延长生存期，并改善体寒血瘀症状及缺血缺氧的指标，降低血清中雌二醇和孕酮水平;丁荟霞[23]实验发现附子生物碱有抑制人胃癌细胞株增殖、降低侵袭力、诱导凋亡的作用并与多种化疗药物存在协同作用，其作用机制可能与下调相关基因的表达有关。白术发挥油是发挥抗癌作用的重要成分，α-香树精、α-桉叶醇皆属白术挥发油类，研究表明其可加速癌细胞凋亡，减缓癌细胞增殖，增强对肿瘤的细胞毒性效应，抑制向正常组织侵袭转移能力等[24]。白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、8-β-乙氧基白术内酯Ⅲ属于内酯类物质[25]，相关研究表明，白术内酯类可对多种癌细胞产生抗癌作用，包括乳腺癌MCF7细胞，白血病P-388、HL-60细胞，肝癌HepG2细胞，前列腺癌Dul45细胞，肺癌A549细胞，黑色素瘤A875、B16细胞，大肠癌Lovo细胞等[26-30]。白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅲ可通过抑制肿瘤坏死因子-α、一氧化氮、白细胞介素、血管内皮生长因子和胎盘生长因子的产生发挥抗炎作用，且白术内酯Ⅰ的作用强于白术内酯Ⅲ[31-32]。与此同时刘昳等[33]发现白术内酯Ⅰ可以显著改善患者恶病质。鉴于此，本研究认为“附子-白术”是多种成分共同发挥作用。其中核心成分可通过诱导肿瘤凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、降低肿瘤侵袭及转移能力发挥抗乳腺癌骨转移作用，通过抗炎作用减少骨痛，并且可改善患者生命质量。

3.2 “附子-白术”治疗乳腺癌骨转移核心靶点分析

本研究依据PPI网络，得到30个核心靶点，其中前5位依次为AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、MAPK1。AKT有3个家族成员AKT1、AKT2、AKT3，可通过PI3K被胞外激活，研究发现激活AKT1可促进乳腺癌的增殖，但抑制AKT1功能会促进肿瘤迁移能力[34-35]。炎症介质可影响恶性肿瘤骨转移，其中白细胞介素-6（IL-6）在诱导肿瘤细胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨细胞生成、抑制成骨细胞分化中具有重要作用[36]。研究发现，乳腺癌骨转移机制是癌细胞突破基膜侵入周围基质，进入脉管系统，在脉管系统中成活并逃避免疫监视，并最终到达转移部位[37]。血管内皮生长因子（VEGFA）有助于新生血管形成，因为肿瘤新生血管的内皮细胞之间没有密切的连接且没有被周细胞广泛覆盖，所以形成新生血管是癌细胞进入脉管的主要方式[38]。MAPK1、MAPK3是一种丝裂素活化蛋白激酶，通过组成信号通路刺激相关因子调节参与乳腺癌的发生发展和转移[39]。鉴于此，本研究认为“附子-白术”是多靶点协同作用共同发挥抗乳腺癌骨转移作用。

3.3 “附子-白术”治疗乳腺癌骨转移通路分析

本研究通过基因KEGG功能富集分析，获得了雌激素信号通路、破骨细胞分化通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路等与乳腺癌骨转移相关的通路。乳腺癌骨转移溶骨性改变是肿瘤细胞激活破骨细胞分化通路所致，通过成骨细胞表达RANKL与破骨细胞前体细胞表面上的RANK受体结合促进破骨细胞分化成熟;同时，成骨细胞可通过骨保护素OPG与RANKL竞争性结合，进而抑制RANK-RANKL通路[40]。肿瘤细胞可分泌PTHrP促进成骨细胞表达RANKL，并且破骨细胞破坏骨质同时释放骨基质中的TGF-β，TGF-β反过来促进肿瘤细胞产生PTHrP，导致使骨质破坏的“恶性循环”[41]。相关研究证实，附子白术汤和附子-白术药对均可抑制TGFβ信号通路，减少PTHrP的表达，调节OPG/RANKL系统，减轻乳腺癌骨转移裸鼠溶骨性损伤[12-14]。亦有研究发现，雌激素信号通路可抑制MCF-7细中OPG表达，提高RANKL通路活性，从而促进破骨细胞的破骨作用[42]。PI3K/AKT信号通路相关蛋白磷酸化增强是乳腺癌侵袭和转移的重要分子机制之一[43]，并且袁翠堂等[44]研究发现PI3K/AKT信号通路参与乳腺癌骨转移大鼠骨癌痛脊髓水平的调节。HIF-1信号通路是乳腺癌骨转移的重要通路，其主要通过促使肿瘤细胞适应缺氧微环境;激活SNAIL1、SLUG和TWIST基因，下调上皮细胞钙黏蛋白表达，使上皮细胞向间叶细胞转化，诱导癌细胞能动性;促进胶原纤维的生物合成以及线性排列，为肿瘤细胞提供迁移途径;激活L1CAM蛋白，增加对于血管内皮细胞的黏附;诱导CXCR4表达，引导癌细胞附到骨组织;有利于骨原始细胞聚集并影响成骨细胞与破骨细胞的分化及活性[45]。MAPK通路中的c-Jun氨基末端激酶参与细胞应激與凋亡，p38激酶可调控炎症反应，细胞外信号调节激酶有利于细胞增殖，大丝裂原活化蛋白激酶可调节细胞周期[46]。目前研究发现阻断ERK/P-38MAPK信号通路可抑制乳腺癌骨转移[47]。鉴于此，本研究认为“附子-白术”通过抑制肿瘤细胞表达PTHrP和骨基质细胞释放TGF-β，以减少成骨细胞表达RANKL;并抑制雌激素信号通路，促进成骨细胞产生OPG，从而阻断破骨细胞分化通路的恶性循环对骨组织的溶骨性破坏。“附子-白术”还通过抑制PI3K/AKT、HIF-1、MAPK信号通路阻止肿瘤细胞的转移，抑制MAPK通路调控肿瘤细胞的增殖与凋亡，抑制PI3K/AKT信号通路减轻骨转移导致的骨痛。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对“附子-白术”药对的多成分、多靶点、多途径与乳腺癌骨转移之间复杂网状关系进行研究，初步验证了“附子-白术”药对治疗乳腺癌的基本药理学作用和相关机制，为进一步深入临床与实验研究奠定基础。

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（2020-04-28收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：杨文辉广东省名中医传承工作室建设项目（粤中医办函[2019]5号）

作者简介：赖琦（1995.01—），女，硕士研究生在读，医师，研究方向：中医防治乳腺疾病，E-mail：353569894@qq.com

通信作者：谢丹（1976.07—），女，博士，主任医师，研究生导师，研究方向：中医防治乳腺疾病，E-mail：xie-dan@21cn.com