酸橙枳实黄酮类抗氧化活性的药效组分研究

贾富霞 王秀娟 罗容

摘要 目的：研究酸橙枳實中黄酮类抗氧化药效组分。方法：利用统计学中偏最小二乘法回归方法，将酸橙枳实黄酮类组分HPLC共有峰峰面积和用清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、总抗氧化能力测定（FRAP）3个抗氧化活性指标结果进行回归分析，得出参与抗氧化作用的药效组分及各组分与抗氧化活性的相关性。用十批药材各药效组分的峰面积平均值计算药效组分之间比例。结果：酸橙枳HPLC图谱中的11个黄酮类组分峰与其抗氧化活性相关。与清除DPPH自由基正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>X1>野漆树苷>柚皮苷>X6>X3，组分间比例为13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2;与清除ABTS自由基正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>野漆树苷>X1，组分间比例为13.8∶1∶3.4;与总抗氧化能力正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>X1>柚皮苷>X3>川陈皮素>橙皮苷>X6>芸香柚皮苷>X4>野漆树苷>X2，组分间比例为13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4。结论：酸橙枳实抗氧化药效效应是多个黄酮类组分协同作用的结果;其中新橙皮苷、野漆树苷和未知成分X1是酸橙枳实黄酮类抗氧化核心药效组分;新橙皮苷、野漆树苷和未知成分X1之间的比例为13.8∶1∶3.4。

关键词 酸橙枳实;药效组分;抗氧化;黄酮类;高效液相色谱法;自由基;总抗氧化能力;偏最小二乘回归

Study on Antioxidative Active Components Alignment of Flavonoids from Aurantii Fructus Immaturus

JIA Fuxia， WANG Xiujuan， LUO Rong

（School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medicinal University， Beijing 100069， China）

Abstract Objective：To study antioxidant active components alignment of flavonoids from aurantii fructus immaturus. Methods：By using the partial least squares regression method in statistics， the HPLC shared peak area of the flavonoids of citrus aurantium and the 3 antioxidant activities of scavenging DPPH free radicals， scavenging ABTS free radicals， and total antioxidant capacity（FRAP） were determined. Regression analysis was performed on the index results， and the pharmacodynamic components involved in the antioxidant effect and the correlation between each component and the antioxidant activity were obtained. The ratio between the effective components of the 10 batches of medicinal materials was calculated by using the average peak area of each effective component of the medicinal materials.Results：A total of 11 active components of flavonoids were relevant with antioxidant activity. The positive correlation of the pharmacodynamic components with DPPH radical scavenging was as follows：new hemperidin>X1>naringin>X6>X3， and the ratio was 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2. For the active components positively correlated with ABTS free radical scavenging， the correlation from large to small was as follows：neohemperidin>wild sumacin>X1， with the ratio of 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2. The positive correlation between the pharmacoactive components and total antioxidant capacity was as follows：neohiresperidin>X1>naringin>anacardin>naringin>X6>X3， the ratio of the components was 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2; the effective components that were positively related to the scavenging of ABTS free radicals， the correlations from large to small were：neohesperidin>rhosperidin>X1， the ratio of the components was 13.8∶1∶3.4; the effective components that were positively related to the total antioxidant capacity， the correlations from large to small were：neohesperidin>X1>naringin>X3>Chrysanthin>Hesperidin>X6>Rutinnaringin>X4>Rhosoprin>X2， the ratio of the components was 13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4. Conclusion：The antioxidant active of Aurantii Fructus Immaturus is the results of synergisticeffect from many kinds of Flavonoids. Among them， neohesperidin， anacardin and unknown component X1 are the core anti-oxidant components of Lime Citrus aurantium flavonoids; the ratio of neohesperidin， anacardin and unknown ingredient X1 is 13.8∶1∶3.4.

Keywords Aurantii Fructus Immaturus; Active components alignment; Antioxidant; Flavonoids; High performance liquid chromatography; Free radical; Total antioxidant capacity; Partial least squares regression

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.009

现代药理学研究发现，器官正常活动或氧化压力过剩产生的活性氧等自由基，在体内超出一定量后会导致或间接导致多种疾病的发生，如衰老、肿瘤、炎症、动脉粥样硬化、高血压、免疫性疾病等[1-8]，因此对天然的具有抗氧化能力的药物研究的越来越多。

枳实为常用中药，传统来源为芸香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果，通称“酸橙枳实”。功效破气消积、化痰散痞，用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂，是中医临床上常用的理气药之一[9]。枳实主要含有生物碱，黄酮和挥发油3大类成分。现代药理研究已表明黄酮类成分有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗肿瘤、抗菌、抗病毒和调节免疫等作用[10-17]，并且课题组前期研究已证实枳实的抗氧化效应明确[18]，但枳实中哪些组分参与了抗氧化作用，目前实验研究还是很少涉及。

我们利用统计学中偏最小二乘法回归方法，将酸橙枳实HPLC组分图谱的共有峰峰面积和用清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、总抗氧化能力测定（FRAP）3个抗氧化活性指标结果进行回归分析，筛选出枳实药材中发挥抗氧化活性的黄酮类药效组分，以期为枳实的药效组分研究和质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

多功能读板仪（美谷分子仪器上海有限公司，型号：Versa max）;电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司，十万分之一，型号：Sartorious）;超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司，型号：KQ-520DE）;96孔板（康宁公司，型号：costar3599）。

1.2 试剂

乙腈（Fisher公司，美国，货号：A988-4）;娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司，批号：20141123）;过硫酸钾（上海国药集团化学试剂有限公司，批号：10017418）;乙酸（北京化工厂，批号：20150911）;甲醇（北京化工厂，批号：20140116）;无水乙醇;（北京化工厂，批号：20140713）DPPH（Sigma公司，美国，货号：1898-66-4）;ABTS（Sigma公司，美国，货号：A1888-5g）;总抗氧化能力监测试剂盒（FRAP法）（碧云天生物技，货号：S0116）。

1.3 分析样品

经首都医科大学中医药学院罗容副教授鉴定为酸橙枳实（Citrus aurantium L.）的干燥幼果。见表1。

2 方法与结果

2.1 枳实的HPLC黄酮类组分图谱测定

2.1.1 样品溶液制备

精密称取枳实药材样品0.5 g（过65目筛），精密称定，置圆底烧瓶中，加水10 mL，100 ℃水浴提取1 h，过滤，残渣再加水10 mL，提取1 h，过滤，将两次滤液合并至蒸发皿中，浓缩至约10 mL，再转移至25 mL容量瓶中，水定容至25 mL，作为样品溶液。

2.1.2 HPLC色谱条件

色谱柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相：乙腈（A）-水（B，含0.2%乙酸）;检测波长：330 nm;柱温30 ℃;流速1.0 mL/min;进样量10 μL;自动进样。流动相梯度洗脱情况见表2。

2.1.3 酸橙枳实HPLC黄酮类组分图谱的研究

精密称取10批枳实药材粉末各0.5 g，分别按照2.1.1项下方法制备样品溶液，依据2.1.2项下HPLC色谱条件，进样10 μL，记录色谱图。将各批次枳实药材的HPLC黄酮类组分图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版，设定匹配（中位数）模板，生成对照组分图谱。其中12个色谱峰为10批样品的共有峰，确定为组分峰（图1）。通过已有对照品确定峰1为芸香柚皮苷、峰2为柚皮苷、峰3为野漆树苷、峰4为橙皮苷，峰5为新橙皮苷、峰10为川陈皮素。X表示未指认药效组分。10批样品的共有组分峰的各自平均峰面积见表3、表4。

2.2 枳实体外抗氧化活性实验

2.2.1 枳实对DPPH自由基清除率的测定

2.2.1.1 DPPH溶液的配制

精密称定DPPH适量，加甲醇溶解，制成浓度约为0.16 mmol/L的DPPH溶液，现配现用。

2.2.1.2 DPPH标准曲线制作

将2.2.1.1项下的母液分别用甲醇配制成浓度为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的DPPH溶液，加入到96孔板中，每个浓度7个复孔，以甲醇溶液为空白对照，在波长517 nm处测定吸光度。经测定，DPPH标准曲线方程y=5.897 4x-0.008 6（r=0.999 0）。见图2，表明DPPH溶液为0.01～1.0 mmol/L和吸光度之间线性关系良好。

2.2.1.3 DPPH清除率的测定

精密吸取质量浓度为0.3 mg/mL的各样品溶液0.1 mL加样在96孔板中，再在每个孔中分別加入DPPH溶液0.1 mL，摇匀，避光放置反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度值。以0.1 mL水溶液和0.1 mLDPPH溶液为对照，以0.1 mL水溶液和0.1 mL甲醇溶液为空白参比。计算各浓度的DPPH清除率。见表5。

清除率（%）=[1-（As-Ao）/Ac]×100%

As—药材溶液加DPPH溶液的吸光度值;Ao—溶剂加DPPH溶液的吸光度值;Ac—溶剂加药材溶液的吸光度值。

2.2.2 枳实对ABTS自由基清除率的测定

2.2.2.1 ABTS工作液的配制

将ABTS水溶液（7.4 mmol/L）和过硫酸钾水溶液（2.5 mmol/L），等量混合避光反应12 h，得到ABTS工作液。使用时用无水乙醇稀释至该溶液在734 nm波长处的吸光度为0.70±0.02。ABTS工作液应在24 h之内用完。

2.2.2.2 ABTS清除率的测定

精密吸取质量浓度为0.037 mg/mL的各样品溶液0.1 mL分别加入ABTS工作液0.1 mL，摇匀，避光放置反应5 min，于波长734 nm处测定吸光度值。以0.1 mL水溶液和0.1 mLABTS工作液为对照，以0.1 mL水溶液和0.1 mL无水乙醇溶液为空白参比。计算各浓度的清除率。见表5。

清除率（%）=[1-（As-Ao）/Ac]×100%

As—药材溶液加ABTS工作液的吸光度值;Ao—溶剂加ABTS工作液的吸光度值;Ac—溶剂加药材溶液的吸光度值。

2.2.3 FRAP法测定枳实药材总抗氧化能力

2.2.3.1 FeSO4标准曲线的绘制

称取27.8 mg试剂盒中提供的FeSO4·7H2O，用蒸馏水溶解并定容到1 mL，此时浓度即为100 mmol/L。取适量100 mmol/LFeSO4溶液分别稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。在波长593 nm下测定各浓度的吸光度，以FeSO4浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线（见图3）。得到FeSO4溶液的标准曲线方程为：y=0.297 4x+0.000 8（r=0.999 9），表明FeSO4溶液在0.15～1.5 mmol/L与吸光度之间线性关系良好。

2.2.3.2 总抗氧化能力测定

根据待测样品的数量，按照试剂盒的说明，配制适量的FRAP工作液（FRAP工作液配制后37 ℃孵育，并在1～2 h内使用完毕）。再按试剂盒方法，进行样品的吸光度测定。依据FeSO4溶液的标准曲线进行计算，结果以样品的mmol Fe2+/g干重来表示。值越大，表明有抗氧化物质还原的越多，即抗氧化物质的抗氧化活性越强。见表5。

2.3 分析方法

根据10批酸橙枳实药材的HPLC黄酮类组分图谱，将已确定的12个共有峰的峰面积和抗氧化活性药效指标利用R语言中的偏最小二乘回归方法进行分析。与功效的相关系数越大表示此组分对此功效贡献越大。相关系数正值表示正相关，负值表示负相关。结果发现柚皮苷、X1、野漆树苷、新橙皮苷、X3、X6、橙皮苷、X4、芸香柚皮苷等成分与DPPH清除率呈正相关;野漆树苷、柚皮苷、X3、橙皮苷、X1、X6组分与ABTS清除率呈正相关;新橙皮苷、柚皮苷、X1、芸香柚皮苷、X3、川陈皮素、橙皮苷、X6、野漆树苷、X4、X2组分与总抗氧化能力呈正相关。见表6。

2.4 实验结果

酸橙枳实HPLC图谱中的11个黄酮类组分峰与其抗氧化活性相关。其中与清除DPPH自由基呈正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>X1>野漆树苷>柚皮苷>X6>X3，组分间比例为13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2;与清除ABTS自由基呈正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>野漆树苷>X1，组分间比例为13.8∶1∶3.4;与总抗氧化能力呈正相关的药效组分，相关性由大到小分别是：新橙皮苷>X1>柚皮苷>X3>川陈皮素>橙皮苷>X6>芸香柚皮苷>X4>野漆树苷>X2，组分间比例为13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4。酸橙枳实抗氧化药效效应是多个黄酮类组分协同作用的结果;其中新橙皮苷、野漆树苷和未知成分X1与3个功效抗氧化功效指标均呈正相关性，是酸橙枳实黄酮类抗氧化作用的核心药效组分;新橙皮苷、野漆树苷和未知成分X1之间的比例为13.8∶1∶3.4。

3 讨论

本实验中用了3个抗氧化指标表征对枳实抗氧化活性。发现对每个指标有贡献的药效组分不一致，可能是因为此3个抗氧化指标测定方法的机制不同。ABTS法和DPPH法都是检测样品对自由基的清除能力，DPPH法是利用抗氧化剂清除DPPH自由基时，与其孤对电子配对而使其在波长517 nm处的吸光值降低，溶液颜色变浅的原理[19]。ABTS法则是当ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS·+，在抗氧化物存在时ABTS·+的产生会被抑制，在波长734 nm处测定ABTS的吸光度即可测定并计算出样品抗氧化能力。而（FRAP法）总抗氧化能力测定则是基于氧化还原反应的比色法，在酸性条件下三价铁被抗氧化剂还原成二价铁在波长593 nm处有强吸收，从而检测抗氧化剂的还原能力[20]。也可能是中药中的天然抗氧化剂的协同作用所致。但通过实验结果也可以看出，与3种抗氧化方法测定出的同时对枳实抗氧化活性有贡献且呈正相关的药效组分为新橙皮苷、野漆树苷和未知成分X1，可认为此3个药效组分是枳实抗氧化活性的主要药效组分。

抗氧化活性主要是表现在抑制脂质氧化降解、清除自由基、抑制促氧化剂和还原能力等方面。由于抗氧化反应的多样性和复杂性，体外评价方法的机制不同，同一种物质在不同评价体系里可能会表现出不同的抗氧化活性，故現在还没有一种方法能综合评价某一物质的抗氧化能力。本实验综合各种抗氧化方法，以快速、简便、灵敏，不需要复杂仪器为原则，选择了清除DPPH自由基、ABTS自由基和总抗氧化能力检测（FRAP法）3种方法来测定枳实的抗氧化活性。

从本实验中得到参与抗氧化作用的黄酮类药效组分，只指认了芸香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、野漆树苷、柚皮苷和橙皮苷等6个组分，X1、X2、X3、X4和X6还未被指认，需要再进一步深入研究。

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（2019-04-22收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81303175）;国家自然科学基金面上项目（81973431）;北京市中医药科技发展资金规划项目（JJ2018-41）

作者简介：贾富霞（1974.02—），女，硕士，副主任技师，研究方向：中药质量控制，E-mail：jfxia74@163.com

通信作者：罗容（1978.11—），女，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：中药鉴定方法学和中药质量评价，E-mail：zhongyaojianding@126.com