不同来源刺柏叶及其易混淆品种的HPLC指纹图谱分析

吴珊珊，徐 瑞，林 燕

（1.内蒙古自治区国际蒙医医院 国家新药临床试验机构，内蒙古 呼和浩特 010065；2.内蒙古医科大学 药学院，内蒙古 呼和浩特 010059；3.内蒙古自治区人民医院 招标采购中心，内蒙古 呼和浩特010017；4.内蒙古自治区药品检验研究院 蒙药室，内蒙古 呼和浩特 010010）

刺柏叶是柏科刺柏属植物杜松Juniperus rigidaSieb et Zucc的干燥嫩枝叶，夏、秋二季采收，除去老枝等杂质，晒干[1]。刺柏叶常应用于蒙医临床，具有清肾热、利尿、燥“协日乌素”、愈伤止血等功效[1-2]，多分布于内蒙古、辽宁、吉林、黑龙江等地，日本、朝鲜也有分布[3]。刺柏叶中含有丰富的化学成分，包括苯丙素苷类、木质素及其苷类、黄酮类、香豆素类、挥发油类、萜类和酚类[4-9]等，具有显著的抗炎[4]、抗肿瘤[6]、抗病毒[10]、抗氧化和抗菌[8]等药理作用。其中，挥发油类在化妆品领域也有着很大的应用价值，是香水、护肤霜等的化学成分之一。另有研究报道，刺柏叶中鬼臼毒素的含量很高，可能会成为因过度采集而濒临灭绝的鬼臼属植物的替代来源，在许多疾病的传统治疗中发挥其抗病毒、抗肿瘤等多种药理活性[5]。

刺柏叶的现行标准《中华人民共和国卫生部药品标准·蒙药分册》中仅规定了性状、显微和理化鉴别项，不能够全面控制刺柏叶药材的质量。已有文献报道刺柏叶HPLC指纹图谱结合一测多评的质量控制研究[11-12]，但并未对药材质量进行综合评价和客观分析[13-14]。刺柏叶易与同属植物如刺柏Juniperus formosanaHayata、西伯利亚刺柏Juniperus sibiricaBurgsd、欧洲刺柏Juniperus communis等的枝叶混淆[2]，故其真伪鉴别和质量控制需要得到更大的重视[13]。鉴于此，本实验对刺柏叶进行了HPLC指纹图谱结合化学计量学评价研究，并对易混淆品种进行了HPLC指纹图谱鉴别研究，为更全面的控制刺柏叶的质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20A型低压四元高效液相色谱仪（日本岛津制作所）；Retsch MM400型混合研磨机（德国莱驰公司）；HH-D4型数显恒温水浴锅（金坛市双捷实验仪器厂）；ME5型百万分之一天平（德国赛多利斯公司）；AE100型万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；PL203型千分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 试剂和试药

甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，天津市盛奥化学试剂有限公司）；超纯水；乙腈（色谱纯，SIGMA-ALDRICH）；穗花杉双黄酮（批号：111902-201102），购于中国食品药品检定研究院；12批刺柏叶（编号S1-S12）均来自内蒙古的不同区域，经原内蒙古食品药品检验所康双龙、周凯两位主任中药师鉴定为杜松Juniperus rigidaSieb et Zucc的干燥嫩枝叶；在采集刺柏叶的过程中，采集到4批易混淆品种（编号C1-C4）,与刺柏叶外观性状和显微鉴别均有所不同，刺柏叶药材及易混淆品种具体来源，见表1。

表1 刺柏叶药材及易混淆品种来源Tab. 1 The source of Juniperus rigida leaves and confused varieties

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱 柱：Phenomenox C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温：30 ℃；流动相：乙腈（A）- 0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，洗脱条件：0 ～ 25 min，16% →27%；25 ～ 30 min，27% → 45%；30 ～ 45 min，45% → 60%；45 ～ 60 min，60% → 80%；检测波长：337 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取刺柏叶粉末（过二号筛）约0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流2.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得[11-12]。

2.3 对照品溶液的制备

取穗花杉双黄酮对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1 mL含17.98 μg的对照品溶液，于4℃保存，备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密性试验 取刺柏叶粉末（S1），精密称定，按“2.2”方法制备供试品溶液，在“2. 1”色谱条件下进行测定，连续进样6次，以穗花杉双黄酮峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.73%，相对峰面积的RSD均小于1.80%，结果表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 取刺柏叶粉末（S1）6份，精密称定，按“2.2”方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下进行测定，以穗花杉双黄酮峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD均小于1.26%，相对峰面积的RSD均小于2.61%，结果表明建立方法的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液于0、4、8、12、16、20、24 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，以穗花杉双黄酮峰为参照峰，各共有峰相对保留时间的RSD均小于0.99%，相对峰面积的RSD均小于2.09%，结果表明供试品溶液在24 h内有良好的稳定性。

2.5 HPLC指纹图谱

2.5.1 HPLC指纹图谱的建立 取12批不同来源的刺柏叶，分别按“2.2”方法制备供试品溶液，再按“2.1”色谱条件进行测定，并将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004A版）进行数据匹配[13]，合成叠加指纹图谱，见图1。根据匹配结果，共标定18个共有峰，并生成对照指纹图谱（R），见图2，指认13号峰为穗花杉双黄酮色谱峰（A）。因穗花杉双黄酮色谱峰分离度好，峰面积较大，故以其为参照物峰计算12批刺柏叶共有峰的平均相对保留时间、平均相对峰面积，结果见表2。12批刺柏叶与对照指纹图谱的相似度范围为0.962 ～0.996，结果见表3。

表2 平均相对保留时间和平均相对峰面积Tab. 2 Average relative retention time and average relative peak area

表3 12批刺柏叶药材的相似度评价结果Tab. 3 Similarity evaluation results of 12 batches of Juniperus rigida leaves

图1 12批刺柏叶叠加图谱Fig.1 Superimposed fingerprint of 12 batches of Juniperus rigida leaves

图2 对照指纹图谱（R）与参照物穗花杉双黄酮（A）叠加图谱Fig.2 Superimposed fingerprint of reference fingerprint (R) and amentoflavone (A)

2.5.2 刺柏叶易混淆品种的鉴别 将4批易混淆品种按“2.2”方法制备供试品溶液，再按“2.1”色谱条件进行测定，并将色谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2004B版）与对照指纹图谱（R）进行数据匹配[13]，得到叠加图谱，见图3，将4批易混淆品种与对照指纹图谱进行比较，可知，有10个相同的色谱峰，分别为1、3、4、5、9、10、12、13、14和17号峰，4批易混淆品种之间的色谱峰也有所差别；相似度评价结果显示，C1、C2、C3和C4与对照指纹图谱的相似度依次为0.951、0.893、0.580和0.943，除C3的相似度很低外，其余3批易混淆品种均较高，见表4。

表4 4批易混淆品种的相似度评价结果Tab. 4 Similarity evaluation results of 4 batches of confused varieties

图3 对照指纹图谱（R）与易混淆品种（C1 ～ C4）叠加图谱Fig.3 Superimposed fingerprint of reference fingerprint (R) and confused varieties (C1 ～ C4)

2.5.3 聚类分析 应用IBM SPSS 25.0统计软件，对12批刺柏叶的18个共有峰峰面积积分值进行标准化处理，再采用组间联接法，以平方欧式距离为测量区间进行聚类分析，结果S2、S6、S9和S10聚为一类，其余批次聚为一类，见图4。

图4 12批刺柏叶药材的谱系图Fig.4 Dendrogram of 12 batches of Juniperus rigida leaves

2.5.4 主成分分析 应用IBM SPSS 25.0软件，以12批刺柏叶药材的18个共有峰峰面积积分值作为变量，标准化处理后进行主成分分析，提取出5个特征值大于1的主成分，累计方差贡献率为90.777%，见表5，表明5个主成分基本可以反映出18个共有峰的大部分信息。

表5 5个主成分的特征值和方差贡献率Tab. 5 Eigenvalues and variance contribution rates of 5 principal components

表6 5个主成分的因子得分值Tab. 6 Factor scores of 5 principal components

表7 12批刺柏叶药材主成分得分、综合得分和排名Tab. 7 Principal component scores, comprehensive scores and ranking of 12 batches of Juniperus rigida leaves

3 讨论

本实验建立的刺柏叶HLPC指纹图谱，共标定18个共有峰，13号峰为穗花杉双黄酮参照物峰，各共有峰的平均相对保留时间RSD均在1.00%以下，表明各批次刺柏叶药材的化学成分基本一致，各共有峰的平均相对峰面积RSD均在21.00%以上，表明各批次刺柏叶化学成分的含量存在一定的差异。通过将4批易混淆品种与刺柏叶对照指纹图谱进行叠加匹配和相似度评价发现，刺柏叶与其易混淆品种的色谱峰数目差别较大，4批易混淆品种之间也各有不同；有3批易混淆品种（C1、C2、C4）与刺柏叶有较高的相似性，采自内蒙古和河北两地；而来自青海的易混淆品种（C3）与刺柏叶的差异很大，说明刺柏叶与其易混淆品种之间存在一定的差异性成分。

由于4批易混淆品种和12批刺柏叶之间存在一定相似性，在同时进行聚类分析时，并不能将二者进行很好的区分。故本实验从评价刺柏叶整体质量的角度出发，仅对12批刺柏叶进行了聚类分析和主成分分析。结合聚类分析结果，由主成分分析所得综合得分排名前四的刺柏叶药材在聚类分析中聚为一类，包括采自乌兰察布市的3批（S2、S9、S10）和阿拉善盟的1批（S6），说明这4批刺柏叶药材的质量更佳。

4 结论

刺柏叶在蒙医临床多与其它药材配伍成复方制剂。为了更广泛的应用刺柏叶，应该建立更为严格的质量控制标准。本实验建立的HPLC指纹图谱，具有一定的专属性，并可有效的对其易混淆品种进行鉴别。结合聚类分析和主成分分析对所采集的12批刺柏叶药材进行整体性评价，发现不同来源刺柏叶药材的质量存在一定的差异性。