宫颈局部炎性因子和T细胞亚群改变对高危型HPV感染的影响

葛爱娟，王小红，邓瑞华

（中国人民解放军联勤保障部队第904医院妇产科，无锡 214000）

宫颈癌在女性生殖道恶性肿瘤中发病率位居第一位，近年来发病率逐年上升且有年轻化的趋势，对妇女健康产生严重危害［1］。随着HPV的筛查力度增加，当前临床宫颈浸润癌确诊率相对降低，但朱春丽等［2］一项研究显示国内成年女性宫颈CIN以及癌前病变发病率逐渐升高。其中CINⅡ/Ⅲ级的高级别CIN自然消退率较低，远低于CINⅠ级，CINⅡ/Ⅲ级发展为浸润癌的风险更大。高危HPV感染是宫颈癌变以及CIN发生的必要条件，其也是各类恶性肿瘤中唯一明确发病原因的种类［3］。随着医疗保健意识及检测水平的提高，国内对HPV筛查以及相关研究的深入，有学者认为HPV感染以及是否发展为CIN及癌变主要取决于宿主自身免疫、局部微环境、病毒等三大因素，而对局部微环境的研究具有更高的可行性［4］。当前国内对多产、性紊乱等辅助致癌因素及阴道微生态变化报道较多，对宫颈局部炎性反应及免疫状态的报道较少，因此本文研究宫颈局部炎性因子和T细胞亚群改变对高危型HPV感染的影响，为女性HPV感染的防控提供理论依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料本研究观察对象为2017年1月～2020年6月我院102例高危HPV 阳性宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）患者，其中CINⅠ级28例，Ⅱ级32例，Ⅲ级 42例，34例宫颈癌患者以及40例HPV 阴性的正常体检者，设为对照组。CINⅠ级年龄23～74岁，平均（49.65±3.67）岁；CINⅡ级年龄22～75岁，平均（49.63±3.54）岁；CINⅢ级年龄22～73岁，平均（50.87±3.59）岁；对照组年龄26～67岁，平均（48.32±3.89）岁；鳞癌29例，腺癌5例；宫颈癌年龄23～70岁，平均（49.32±3.80）岁；5组年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入与排除标准年龄22岁～60岁女性；有性生活史，入组时非妊娠期、月经期及哺乳期；未合并其他组织恶性肿瘤；无免疫性疾病；入院检查前3d无性生活、阴道用药、检查史；患者精神状况良好知情并配合检查；排除标准：合并感染性、免疫性疾病或营养不良；近期手术史或急性心脑血管疾病等严重内科疾病；近期服药影响免疫系统药物；无盆腔创伤或合并恶性肿瘤。

1.3 方法

1.3.1 HPV检测所有受试对象均进行常规HPVDNA检测，采用无菌窥器将宫颈阴道部暴露，无菌棉球将宫颈口黏液轻拭后再采用1支专用分泌物无菌棉拭子进行标本采集，并保存于EP管。采用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）与膜杂交检测HPVDNA，包括16、18、31、33、35、39、45等15种高危HPV亚型。HPV检测试剂盒选择豪洛捷®AptimaTM HPV检测试剂盒（美国），由杂交检测试剂以及 HPV核酸扩增试剂组成，采用导流杂交原理以及基因扩增技术，通过碱性磷酸酶系统进行定性检测，严格按试剂盒说明书操作，每份HPV亚型DNA≥110pg/mL判为HPV感染阳性，分为单一感染与多重感染（两种及以上亚型）。

1.3.2 宫颈局部炎性因子和T细胞亚群检测按1.3.1步骤采集宫颈分泌物，装入3mL生理盐水的试管中，1500r/min下离心10min分离上清液，采用赛默飞Attune NxT流式细胞仪（美国，赛默飞世尔科技有限公司）检测其中CD4＋、CD8＋等T淋巴细胞亚群水平，并计算CD4＋/CD8＋比值。INF-γ、IL-4、TNF-α、IL-2通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，ELISA检测试剂盒购自武汉默沙克生物科技有限公司，检测步骤根据试剂盒说明书进。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.00软件，计数资料均以“%”表示，组间采用χ2检验，计量资料均采用mean±SD表示，组间、组内多组比较分别采用独立样本t检验以及重复方差分析，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 CIN与宫颈癌患者高危HPV感染情况宫颈癌患者单一感染率显著低于CIN患者，多重感染率显著高于CIN患者，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1，高危HPV感染情况见表2。

表1 CIN与宫颈癌患者高危HPV感染情况［例（%）］

2.2 不同宫颈病变程度患者宫颈分泌物T淋巴亚群水平比较宫颈癌组及CIN组宫颈分泌物CD4＋水平显著高于对照组，CD4＋/CD8＋显著低于对照组，宫颈癌组与CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组差异具有统计学意义（P＜0.05），CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同宫颈病变程度患者宫颈分泌物T淋巴亚群水平比较

2.3 不同宫颈病变程度患者宫颈分泌物T淋巴亚群水平比较宫颈癌组及CIN组宫颈分泌物IL-4、TNF-α水平显著高于对照组，INF-γ、IL-2显著低于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），宫颈癌组与CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组差异具有统计学意义（P＜0.05），CINⅠ级、Ⅱ级、Ⅲ级组组间差异具有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同宫颈病变程度患者宫颈分泌物T淋巴亚群水平比较（ng/L）

3 讨论

HPV属于嗜人黏膜、皮肤复层鳞状上皮的一类DNA病毒，是常见的经性途径传播的病毒，与人类食管癌、肛周癌，男性尖锐湿疣、阴茎癌以及女性宫颈癌、外阴癌等多种疾病的发生具有紧密联系［5］。上个世纪70年度德国病毒学家在宫颈癌组织中首先发现了HPVDNA，随后的研究证实HPV感染与子宫颈癌以及CIN发生与发展具有密切联系。国内报道成年女性HPV感染率为10.20%～40.00%，但并非全部HPV感染者均会发展为宫颈癌，其中 5～10 % HPV感染者会因自身免疫因素或微生态因素无法清除病毒，并长时间维持高水平感染状态［6］。众多报道均证实16、18、31等高危HPV亚型使癌前病变及CIN的风险增加，同时A Qureishi等［7］报道随病变程度增加，单一HPV亚型感染率显著上升，宫颈鳞癌中单一高危HPV感率较高，本研究宫颈癌患者单一感染率显著低于CIN患者，多重感染率显著高于CIN患者，差异具有统计学意义，与之报道一致。

T淋巴细胞在病原体的防御中起到极为重要的作用，其中CD4+与CD8+ 对人细胞免疫反应具有调节作用，并能维持免疫平衡，CD4+/CD8+数值下降提示机体存在一定的免疫缺陷［8］。CD4+主要分化为辅助性T 细胞1、2（Th1、Th2），两者发挥相互拮抗作用于免疫调节。本研究表明宫颈癌组及CIN组宫颈分泌物CD4＋水平较正常人群明显升高，而CD4＋/CD8＋更低，表明机体免疫功能下降与高危HPV的感染可能存在关联［9］。当阴道黏膜被病原体侵袭时，免疫系统发挥着预防阴道感染的重要作用，除全身性免疫外，宫颈、阴道黏膜作为一道重要的防御屏障在防御病原菌侵入中发挥重要作用，这与局部细胞免疫关系密切。

Th1以及相关炎性因子在细胞免疫中扮演着重要角色；INF-γ、IL-2由Th1释放，能够激活肿瘤、病毒细胞的死亡受体进而产生杀伤作用［10］。Th2增加对细胞免疫具有抑制作用，削减T细胞的抗肿瘤及抗病毒效应。Th1、Th2拮抗作用被打破便会表现出免疫应答紊乱，使HPV感染加重［11］。本研究纳入研究的炎性因子中IL-2是免疫调节与应答的核心因子，其活性对宫颈局部免疫状态以及免疫细胞的免疫功能产生直接影响，IL-2表达量上升对巨噬细胞杀伤活性起到增强作用。而IL-4来源于激活的Th2，能够加快Th 向Th2分化，但对Th向Th1细胞分化具有抑制作用，进而影响细胞功能［12］。R Dhanwani等［13］报道显示CIN级别的增加宫颈分泌物IL-4、IL-6、TNF-α表达量显著增加，同时宫颈癌宫颈分泌物IL-4、IL-6、TNF-α表达量也显著高于CIN患者与正常组，本研究结果与之保持高度一致性。表明IL-4、TNF-α水平增加，INF-γ、IL-2水平降低可能降低宫颈局部抵抗力，高危HPV感染风险增加，加速宫颈病变［14］。

综上所述，高危HPV感染患者随颈病变程度加重宫颈局部CD4＋水平及CD4＋/CD8＋降低，提示局部细胞免疫功能下降，加快病变发展，宫颈组织炎症反应水平可能影响高危型HPV的感染程度。