昆仙治疗狼疮性肾炎作用机制的网络药理学研究

刘姗姗，王凯，李慧，刘焱，李鞠，孟德钎，张钟元

（南京医科大学附属淮安一院风湿免疫科，江苏 淮安 223001）

0 引言

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是一种多因素参与的，累及全身多系统的自身免疫病，如未得到及时和有效的治疗，会造成受累脏器的不可逆损害，最终导致患者死亡。狼疮性肾炎(lupus nephritis, LN)是SLE的最主要并发症和死亡原因，目前LN的主要治疗手段为激素及免疫抑制剂，但上述药物往往也带来众多的不良反应[1]。

中药昆明山海棠是一种民间常用药，在植物分类学上与雷公藤亲缘关系接近，其临床应用、毒性等也与雷公藤相似。因其在治疗自身免疫性疾病方面相对雷公藤的作用更加缓和，被广泛应用于类风湿关节炎[2]、银屑病关节炎[3]等疾病的治疗。“九五”国家中医药重点科技攻关项目成果-昆仙胶囊便是以昆明山海棠为主要成分。我们在前期的临床研究中发现，昆仙胶囊联合糖皮质激素治疗LN效果不劣于环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)；对女性卵巢功能损害与CTX 相当，消化、血液等系统不良反应较低[4]。但尚没有研究能系统阐明昆仙胶囊治疗LN的药效物质基础及分子作用机制。因此，本研究以中药的多靶点整体调控为切入点，尝试使用网络药理学方法，分析昆仙胶囊治疗LN可能的药效物质基础及分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 数据库和软件

中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP），在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM），人类基因组注释数据库（GeneCards），Uniprot数据库，蛋白相互作用数据库（STRING），Cytocape3.7.2软件，R version 3.6.3软件。

1.2 活性化合物的筛选

将昆仙胶囊成分昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子和菟丝子分别输入TCMSP。昆仙胶囊为口服制剂，因此为了筛选潜在活性化合物，使用口服生物利用度（oral bioavailability, OB）和药物相似性（drug-likeness, DL）筛选出合适的化合物。OB是指药物经口服给药后药物被机体吸收进入全身血液循环的相对量和速率，是决定生物活性分子类药性的关键指标。因生物碱的OB较低，本研究选择OB≥30%作为筛选条件。DL是指化合物与目前已知药物的相似性，若DL≥0.18，则可认为该化合物与Drugbank数据库里药物具有一定的相似性。因此，本研究以OB≥30%及DL≥0.18的化合物视为潜在活性化合物进行进一步分析。

1.3 LN相关靶点筛选

为了收集LN相关靶点，将“lupus nephritis”作为关键词在OMIM及GeneCards数据库进行检索，下载LN相关靶点，并对收集的靶点信息进一步筛选，最终将获得的靶点进一步映射到Uniprot数据库归一化和标准化命名，最终整合并建立化合物-疾病靶点数据库。

1.4 昆仙胶囊所含化合物的收集与筛选结果

筛选出昆仙胶囊的活性化合物共122个，其中昆明山海棠有效成分51个，淫羊藿15个，菟丝子11个，枸杞子45个。

1.5 网络构建与分析

为了阐明昆仙胶囊的治疗LN的机制，本研究构建了可视化网络以更好的展示化合物-疾病靶点之间的相互作用。若某个化合物与疾病靶点之间存在一定的关系，则在网络中显示该化合物与靶点相连接。网络图利用Cytoscape 3.7.2构建。化合物的节点上代表了化合物对应的预测LN相关靶点的个数，节点的度数是与节点相连的边的数量，度数越大，说明网络中与该节点直接相关的节点数越多，表明该节点在网络中的重要性越大，是化合物的关键作用靶点的可能性也就越大。以网络节度(degree)≥10的靶点和成分，为复方的核心成分和关键靶点。

1.6 GO生物功能过程和KEGG代谢通路富集分析结果

本研究利用R软件的clusterProfiler包对差异表达基因进行GO(gene ontology，GO) 功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of gene and genome, KEGG)通路富集分析。本研究将筛选条件设定为校正后Padj<0.05。结果以气泡图或条形图形式呈现，并根据富集因子值分析核心通路富集程度。

2 结果

2.1 昆仙胶囊活性化学成分及作用靶点预测

从TCMSP数据库中得到昆仙胶囊已知成分，根据OB≥30%、DL≥0.18筛选出昆仙胶囊的活性化合物共122个，其中昆明山海棠有效成分51个，淫羊藿15个，菟丝子11个，枸杞子45个。

2.2 LN相关靶点筛选

由TCMSP数据库中得到共3960个靶点蛋白，利用Uniprot数据库将靶蛋白转为对应的基因名称后，与从OMIM及GeneCards数据库中得到的1259个LN相关基因进行对比，筛选得到107个昆仙胶囊治疗LN的潜在靶点，获得联系其他靶点个数排名前30位的靶点如图1所示。

图1 昆仙胶囊中化合物的作用靶点分布

2.3 候选化合物-LN靶点网络分析

运用Cytoscape对昆仙胶囊活性成分的治疗LN靶点进行PPI 网络构建，靶点之间的相互关系如图2所示（黄色为degree10）。从蛋白靶点角度来看，degree10的靶点共14个，前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2，degree=50)，PTGS1(degree=33)，过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG，degree=21)，毒蕈碱型乙酰胆碱受体M3(CHRM3，degree=19)，丝氨酸蛋白酶1(PRSS1，degree=18)，雌激素受体1(ESR1，degree=13)，一氧化氮合酶 2(NOS2，degree=13)，胱天蛋白酶3(CASP3，degree=12)等。从化合物角度来看，degree≥10的靶点共10个，槲皮素(degree=235)，山奈酚(degree= 88)，β- 谷 甾 醇 (degree= 37)，雷 公 藤 甲 素 (degree=29)，蜜 桔 黄素 (degree=20)，淫羊藿苷元 (degree= 12)，豆甾醇 (degree=11)，黄豆黄素(degree=10)，8-异戊烯基山奈酚(degree=10)，5,8-二羟基-7-（4-羟基-5-甲基-香豆粗-3-基）-香豆精(degree=10)，是昆仙胶囊治疗LN较为重要的部分。

图2 昆仙胶囊的化合物-靶点作用网络

2.4 昆仙胶囊生物功能过程和代谢通路富集分析结果

通过R软件的clusterProfiler软件包对筛选出的差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析.其中GO功能分析结果如图3所示，差异表达基因主要定位于细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、核受体活性、转录因子活性等。KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因主要参与糖基化终产物-晚期糖基化终产物受体（Advanced Glycation Endproducts-Receptor of Advanced Glycation Endproducts, AGE-RAGE）、肿 瘤 坏 死 因 子（tumor necrosis factor, TNF）、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、白介素（Interleukin, IL）-17、Toll样受体等信号通路(图4)。其中最重要的AGE-RAGE通路如图5所示。

图3 昆仙胶囊活性化合物-LN潜在靶点生物学过程的GO分析

图4 昆仙胶囊活性化合物-LN作用靶点的KEGG分析

图5 昆仙胶囊在AGE-RAGE信号通路中的作用靶点

3 讨论

雷公藤是迄今为止治疗风湿免疫性疾病疗效最为确切的一味中药，用于 SLE、LN 治疗已有40年的历史[5]，但其对生殖系统的毒性作用限制了雷公藤类药物的广泛应用[6]。昆仙胶囊是雷公藤多甙片升级换代产品，由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子和菟丝子组方而成，具有祛风除湿、活血通络、护肾等功效，且相对雷公藤而言，昆仙胶囊组方中的其他成分：淫羊藿[7]、枸杞子[8]和菟丝子[9]能够拮抗雷公藤制剂所致的生殖毒性。本研究使用了网络药理学研究方法，对昆仙胶囊活性成分进行筛选，研究其多成分-多靶点-多通路作用机制，

以阐释其治疗LN的基本原理。首先，筛选得到122个昆仙胶囊的生物活性成分；其次，本研究共获得LN相关靶点共计1259个，并构建相互作用网络获取相关靶点107个。关键靶点包括 PTGS2、PTGS1、NOS2、TNF、IL-6等，上述靶点均与LN的发生发展高度相关。

对靶点的富集分析结果显示，昆仙胶囊治疗LN的靶点可能与AGE-RAGE、流体剪切应力与动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、Toll样受体、IL-17、TNF等信号通路等密切相关，这些作用通路可能是昆仙胶囊发挥治疗LN作用的依据。AGE-RAGE信号通路是本研究所得到的最关键通路，此通路在SLE及LN中的研究尚未见报道，但目前的研究显示，高水平的AGE可通过RAGE引起足细胞凋亡，导致先天性免疫反应和足细胞凋亡[10]。通过抑制AGE-RAGE信号通路，能够改善肾小球内皮细胞及足细胞[11,12]，对肾脏有一定的保护作用[13]。

肾微血管病变普遍存在于LN的病理表现中，动脉粥样硬化型是LN中较为常见的血管病变，与无肾微血管病变的狼疮性肾炎患者相比，动脉粥样硬化型患者的年龄偏大、血肌酐水平较高、平均动脉压较高，并且肾脏病理上的慢性化指数更高[14]。流体剪应力来源于血液或尿液等流体流动产生的机械力，剪应力由流速、血管几何形状和流体粘度决定，可以调节组织形态发生[15]，特别是血管中的管腔直径，它也有助于各种人类疾病的进展，如动脉粥样硬化[16]。我们的研究显示首次发现流体剪切应力与动脉粥样硬化这一条信号通路可能也是昆仙胶囊治疗LN的重要靶点之一。

疱疹病毒感染是SLE患者使用免疫抑制剂治疗过程中的主要并发症，尤其是在肾脏疾病患者中。在这种情况下，肾功能受损既是感染的罪魁祸首也是受害者[17]。我们的分析显示了昆仙胶囊对LN中卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染这一条信号通路也有一定的作用。除上述信号通路以外，我们研究所提示的IL-17[18]、Toll样受体[19]、TNF[20]等信号通路在各项研究中均提示了与LN的发生发展有关，针对以上信号通路的治疗将给LN带来益处。

以上研究均提示了，多条信号通路参与了LN发生发展的过程，缓解LN的治疗可能需要多个靶点的联合治疗。系统性红斑狼疮具有多靶点、多环节的特点，昆仙胶囊富含多个有效成分，是治疗LN的有效药物。但同时，昆仙胶囊也正是因为成分较多、作用靶点多的特点，使得作用机制不明确，很难进行全面系统地研究。通过我们的研究，希望能够为LN的治疗提供新的思路。但这些结果都有待于通过药理实验进行验证。未来有必要以本研究的预测结果为基本方向，通过设计相关实验，验证昆仙胶囊治疗LN的具体机制。