化学分子伴侣及诱导条件协同强化Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达

段绪果 张玉华 黄婷婷 丁乾 栾舒越 朱秋雨

（南京林业大学轻工与食品学院，南京 210037）

α-葡聚糖磷酸化酶（EC 2.4.1.1）广泛存在动物、植物和微生物中，能够催化α-1，4-葡聚糖的可逆性磷酸解反应，该酶属于糖基转移酶35家族［1-2］。不同来源的α-葡聚糖磷酸化酶催化机制非常相似，几乎都需要5-磷酸吡多醛作为辅因子，以及一段短寡糖链作引物。α-葡聚糖磷酸化酶构成了一个具有高度同源性的大家族，包括：糖原磷酸化酶、淀粉磷酸化酶和麦芽糊精磷酸化酶。这些酶的调节机制及底物特异性均有所不同。如来源于兔肌肉及土豆中的α-葡聚糖磷酸化酶分别为典型的调节与非调节的酶，前者受到别构效应调节，而后者不受别构效应调节［3］。

α-葡聚糖磷酸化酶可用于制备葡萄糖-1-磷酸［4］、直链淀粉［5-6］及pH敏感水凝胶［7］等高附加值产物［8］。其中，葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G-1-P）是糖代谢中重要的中间产物，具有重要的药用价值，可作为制备细胞增殖抑制剂和抗生素等产品的原料。α-葡聚糖磷酸化酶能够以廉价的淀粉质、糊精等原料为底物，通过催化可逆性磷酸解反应，催化形成葡萄糖-1-磷酸。国外对利用葡聚糖磷酸化酶催化淀粉底物制备葡萄糖-1-磷酸的研究较早，1994年Andreas等将重组麦芽糊精磷酸化酶固定在超滤反应器上，以麦芽糊精为底物连续生产葡萄糖-1-磷酸，在30℃，pH 7.5条件下，产率达2.6 g/L/h。但是麦芽糊精磷酸化酶为常温酶，热稳定性差，不能满足工业需求，所以高温磷酸化酶逐渐受到重视［9］。近年来随着嗜热微生物来源高温α-葡聚糖磷酸化酶的开发，国内外对该酶的研究逐渐增多［10］。2005年，Bae等［4］对Thermus caldophilus α-葡聚糖磷酸化酶进行分离纯化，在70℃条件下以可溶性淀粉为原料制备葡萄糖-1-磷酸，产率达69.78%。2016年Zhou等［11］采用Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶与异淀粉酶等复配转化淀粉，葡萄糖-1-磷酸最高产量可以达到52 g/L。2016年，张尧等［12］利用重组Pyrococcus furiosus α-葡聚糖磷酸化酶转化普通玉米淀粉来制备葡萄糖-1-磷酸，转化率达到65.1%。虽然酶法合成葡萄糖-1-磷酸取得一定的进展，但仍存在一些不足，如α-葡聚糖磷酸化酶产量较低，使用成本较高等问题。

由于直接利用嗜热微生物发酵制备α-葡聚糖磷酸化酶存在产量低、发酵条件苛刻、成本高等问题。异源重组表达是获得高温α-葡聚糖磷酸化酶的主要方式，其中大肠杆菌表达系统的应用最为普遍。尽管大量外源蛋白已经成功实现了在大肠杆菌表达系统中过量表达，但是多数蛋白异源表达过程中非常容易形成无活性的包涵体，导致可溶性表达水平偏低，这是限制大肠杆菌表达系统广泛应用的主要瓶颈之一。目前，有多种途径被用来提高异源蛋白的表达水平，如培养条件优化、融合表达、共表达分子伴侣、添加渗透压调节剂（化学分子伴侣） 等［13-14］。其中，共表达分子伴侣或添加化学分子伴侣均可以在细胞内部稳定蛋白折叠构象、促进蛋白正确折叠，从而减少蛋白聚集及包涵体形成，提高可溶性蛋白所占的比例［15］。由于不同蛋白组成及结构不同，导致蛋白折叠中间体以及折叠和聚集动力学存在显著差异，而且影响蛋白质折叠和聚集的机制极其复杂，因此很难预测哪种分子伴侣、化学分子伴侣对特定蛋白的折叠具有促进作用。研究发现，采用实验优化的方法来筛选对特定蛋白具有促进作用的因素，是一种行之有效的方法。

本研究构建了产T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重组菌株，为进一步提高重组酶可溶性表达水平，分别从诱导条件（诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间）和分子伴侣（共表达分子伴侣、化学分子伴侣种类及浓度）两个方面对重组酶可溶性表达的影响进行了考察，以期为α-葡聚糖磷酸化酶的高效制备和应用提供的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 pET24a（+）、E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）、分别含有1种分子伴侣质粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的 宿 主细胞E. coli BL21（DE3）为本实验室保藏。海栖热袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶编码基因α-GPtm为上海生工生物工程有限公司合成，该基因根据大肠杆菌密码子偏好性进行了优化，基因片段两端酶切位点分别为NdeⅠ和Hind Ⅲ，该基因被连接在克隆载体pUC57中，命名为pUC57-α-GPtm。

1.1.2 试剂 限制性内切酶Nde I、Hind III、T4 DNA连接酶和CIAP等购自大连宝生物工程公司。质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。异丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、氨苄青霉素（Amp）、卡那霉素购自上海生工生物工程公司。UTP（尿苷三磷酸），PPase（无机焦磷酸化酶）和UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）购自Sigma-Aldrich公司。蛋白胨和酵母粉购自Oxoid公司。其它试剂均为国产分析纯，购自国药集团。

1.1.3 培养基 LB培养基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，121℃灭菌30 min，使用前加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素或者30 μg/mL的卡那霉素。固体LB培养基在此基础上添加1.5%（W/V）琼脂粉。

TB培养基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31，甘油5，用1 mol/L NaOH调pH至7.0-7.2，121℃灭 菌30 min，使用前加入终浓度为30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 质粒的构建及转化子筛选 将带有目的基因的克隆载体pUC57-α-GPtm经过Nde I和Hind Ⅲ酶切，并与经过相同酶切并去磷酸化的表达载体pET24a（+）连接，连接产物转化E. coli JM109，涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上，培养过夜筛选转化子。挑取转化子至含有30 μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，培养后提取质粒。经酶切验证且测序正确的质粒pET24a-α-GPtm直接转化表达宿主E. coli BL21（DE3），涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上进行筛选。挑取阳性转化子接入LB培养基中培养过夜，并保存甘油管备用。

1.2.2 分子伴侣共表达系统的构建 分别将含有1种分子伴侣质粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pGTf2和pTf16的E. coli BL21（DE3）宿主细胞进行培养，采用标准流程制备感受态细胞。将表达载体pET24a-α-GPtm分别转化感受态细胞，得到带有不同类型分子伴侣质粒的共表达菌株。

1.2.3 重组菌的摇瓶发酵 种子培养：从-80℃ 保藏的甘油管中取20 μL菌液，接种于含有Kan抗性的10 mL LB培养基中，37℃、200 r/min，培养8 h。

摇瓶发酵：以5%（V/V）接种量将活化的菌体转接至装液量为50 mL TB培养基的250 mL三角瓶中。37℃、200 r/min，培养4 h，加入0.8 mmol/L IPTG诱导，继续培养至20 h。

发酵条件优化：分别对诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间、化学分子伴侣种类及浓度和共表达分子伴侣等因素进行优化。共表达分子伴侣的重组菌株发酵方法参考TaKaRa公司分子伴侣质粒系统使用说明。

样品制备：将摇瓶发酵所得菌液，于4℃ 离心收集菌体、8 000 r/min离心10 min弃上清，收集菌体；用0.02 mol/L磷酸缓冲溶液进行充分悬浮，在4℃ 下进行超声细胞破碎仪处理细胞，处理方式是：200 W，工作3 s，间歇5 s，共处理10 min。在此过程中，菌液始终置于冰水混合浴中。将细胞破碎液于4℃、8 000 r/min离心10 min除去细胞碎片沉淀，上清为含有α-葡聚糖磷酸化酶的粗酶液。

1.2.4 菌体生物量的测定 发酵液浊度（OD600）测定：以去离子水为空白对照，将发酵好的菌液稀释适当倍数后，用UVmini-1240紫外分光光度计测定其于600 nm处的吸光值A600。稀释倍数以在0.2-0.8之间为宜，则OD600=A600×稀释倍数。

细胞干重测定：取一定量发酵液于12 000 r/min下离心5 min，用生理盐水洗涤两次，离心后菌泥于105℃烘至恒重后称重。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析 根据α-葡聚糖磷酸化酶的分子量，分离胶选用12% SDS-PAGE（＞10 kD）的电泳方案。电泳凝胶配方，电泳参数及凝胶的染色、脱色方法均参照标准实验方法进行。

1.2.6 α-葡聚糖磷酸化酶活力的测定 酶活力测定方法参考张尧等［12］并根据所用酶的特点进行调整。反应总体积为1.0 mL，该体系含有50 mmol/L PBS缓冲液（pH 7.2），2 mmol/L MgCl2，1%可溶性淀粉，2 mmol/L UTP，5 U/mL PPase及3 U/mL UGPase，以包含除酶外所有底物的体系作为对照，70℃反应10 min，加入次氯酸终止反应，再用氢氧化钾调节pH至7.0。12 000×g，4℃离心10 min 除去变性酶蛋白，上清液进行HPLC 分析。HPLC 条件为，Agilent 5 TC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），检测波长260 nm，流动相为50 mmol/L 甲酸铵（pH3.5），流速1.0 mL/min，柱温30℃，进样量10 μL。

酶活定义：在上述反应条件下，每分钟形成1 μmol 葡萄糖-1-磷酸所需的酶量定义为1个酶活力单位。

2 结果

2.1 重组菌株的构建及验证

首先，将含有目的基因的克隆载体pUC57-α-GPtm进行双酶切、胶回收并纯化得到2.4 kb左右的目的基因片段。将该基因片段与同样酶切纯化回收的表达载体pET24a（+）连接后转化E. coli JM109，挑选阳性克隆，转接LB培养基，培养后再提取质粒。重组质粒经Nde I和Hind Ⅲ双酶切，核酸电泳检测结果显示得到两条大小分别为5.3 kb和2.4 kb的条带，结果与预期相符，证明α-GPtm基因已成功连接到表达载体中。将重组质粒转化表达宿主E. coli BL21（DE3），得到重组菌株E. coli BL21（DE3）/ pET24-α-GPtm。

重组菌株在37℃条件下进行培养并经过0.8 mmol/L IPTG诱导，培养24 h取样测定酶活力，酶活力为5.2 U/mL。利用12% SDS-PAGE对重组菌的发酵上清和全细胞进行蛋白电泳检测，在发酵液和细胞中都有与目的重组蛋白理论分子量相一致的条带，条带大小约为90 kD（图1），而还有空载体的对照菌株样品没有相应条带出现。酶活力测定及蛋白电泳结果都表明重组α-葡聚糖磷酸化酶成功实现了表达。SDS-PAGE蛋白分析发现，重组蛋白可溶性表达水平偏低，存在较多包涵体。

图1 重组菌株及对照菌株发酵产α-葡聚糖磷酸化酶SDS-PAGE电泳图Fig. 1 SDS-PAGE analysis of α-glucan phosphorylase produced by the recombinant strains and the control strain

2.2 诱导剂浓度对重组菌生长及产酶的影响

诱导剂对重组蛋白的表达水平及状态具有重要的影响，因此非常有必要对诱导剂的种类及浓度进行考察及优化。本研究中所用表达载体为pET24a（+），该载体的启动子是T7启动子。T7启动子处于LacI阻遏蛋白的调控下，当添加诱导剂进行诱导时，阻遏蛋白与诱导剂结合并发生构象改变，从操纵基因上脱离并激活T7 RNA聚合酶的转录、表达，最终激活T7启动子控制下的目的基因的表达。T7启动子常用的诱导剂是乳糖和IPTG。本研究分别对不同浓度的乳糖和IPTG对重组菌生长及产酶的影响进行了考察。

2.2.1 乳糖浓度对重组菌生长及产酶的影响 由图2可知，当以乳糖为诱导剂时，不同浓度的乳糖对菌体生长和α-葡聚糖磷酸化酶产量的影响不同。当乳糖浓度为0 g/L、5 g/L和10 g/L时，菌体浓度没有明显变化，发酵液细胞干重都在4.0 g/L左右；当乳糖浓度超过10 g/L时，继续提高乳糖浓度，菌浓开始下降，当乳糖浓度为20 g/L时，细胞干重只有3.5 g/L。乳糖对α-葡聚糖磷酸化酶的产量也有明显影响，不加乳糖诱导剂时，酶活力只有1.4 U/mL，当乳糖浓度为5 g/L时，酶活力最高，为12.0 U/mL；继续提高乳糖浓度，酶活力开始降低。

图2 乳糖浓度对重组菌生长、产酶的影响（A）和细胞破碎上清SDS-PAGE电泳图（B）Fig. 2 Effect of lactose concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.2.2 IPTG浓度对重组菌生长及产酶的影响 由图3可知，当以IPTG为诱导剂时，当IPTG浓度低于0.05 mmol/L时，对菌体生长没有影响；当IPTG浓度高于0.05 mmol/L时，随着IPTG浓度的升高，菌体浓度逐渐降低；当IPTG浓度为0.4 mmol/L时，发酵液细胞干重为3.5 g/L，只有IPTG为0.05 mmol/L时菌体浓度的85%。上述结果显示高浓度的IPTG会抑制细胞的生长，原因是IPTG对重组细胞具有一定的毒性。当IPTG浓度在0 mmol/L和0.2 mmol/L之间时，随着诱导剂浓度的提高，重组α-葡聚糖磷酸化酶逐渐提高，最高酶活力15.1 U/mL是不加诱导剂时酶活力的12.6倍。当IPTG浓度高于0.2 mmol/L时，重组α-葡聚糖磷酸化酶明显下降；当浓度达到0.4 mmol/L时，酶活力只有11.2 U/mL。这种现象与Jhamb等在报道的结果类似，Jhamb等发现木聚糖酶在大肠杆菌中重组表达时，IPTG浓度对重组蛋白的可溶性具有重要的影响，当IPTG浓度过高时重组木聚糖酶主要以包涵体形式存在，可溶性酶比例 降低［14］。

图3 IPTG浓度对重组菌生长、产酶的影响（A）和细胞破碎上清SDS-PAGE电泳图（B）Fig. 3 Effect of IPTG concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

根据诱导剂（乳糖和IPTG）优化结果可以看出，以IPTG为诱导剂时，重组α-葡聚糖磷酸化酶最高活力是以乳糖为诱导剂时最高酶活力的1.3倍，因此本研究后续实验采用IPTG为诱导剂。

2.3 诱导温度对重组菌生长及产酶的影响

诱导温度是影响重组蛋白表达的另一个重要因素，在发酵过程中应严格地控制该参数，以获得最佳生产效率。一般来说，诱导温度高，表达强度大，重组蛋白较易形成包涵体；而低诱导温度可以降低表达速度，减少包涵体的形成并提高可溶性重组蛋白的比例。本研究首先将重组菌在37℃培养4 h，然后分别25、28、30、33和37℃条件下加入诱导剂对重组菌进行诱导培养，并对重组菌生长及产酶情况进行分析。如图4所示，随着培养温度的升高，菌体浓度和酶活力变化趋势一致，都是先升高再降低。当诱导温度为28℃时，发酵液中细胞干重和酶活力分别为4.3 g/L和22.8 U/mL。继续提高诱导温度，菌浓缓慢降低，而酶活力快速下降。当诱导温度为37℃时，重组α-葡聚糖磷酸化酶活力只有9.5 U/mL，是28℃时酶活力的41.7%。在对2种融合蛋白VP1-GFP和VP1-LAC的重组表达过程中发现低温可以明显的提高重组蛋白的质量；而高温培养时，重组蛋白折叠效率降低，更容易形成蛋白聚集体。为了提高重组酶的可溶性表达水平，本研究后续实验采用28℃作为重组菌株的诱导培养温度。

图4 诱导温度对重组菌生长、产酶的影响（A）和细胞破碎上清SDS-PAGE电泳图（B）Fig. 4 Effect of induction temperature on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.4 诱导剂添加时间对重组菌生长及产酶的影响

根据2.2节中研究结果可知，本研究选用IPTG作为最佳诱导剂，除诱导剂浓度对重组蛋白表达具有重要影响外，诱导剂添加时间是另外一个重要参数。本研究选择接种后0 h、2 h、4 h、6 h和10 h，分别添加0.2 mmol/L IPTG进行重组酶的诱导表达。如图5所示，诱导剂添加时间对重组菌株的生长和产酶都具有非常明显的影响。过早添加诱导剂（0 h和2 h）时，菌体生长和产酶都会受到明显抑制，0 h添加诱导剂，发酵液细胞干重和酶活力分别为1.1 g/L和6.1 U/mL。随着诱导剂添加时间的增加，菌浓和酶活力都逐渐增加。当诱导剂添加时间为6 h时，发酵液细胞干重和酶活力分别为4.1 g/L和27.0 U/mL，分别是0 h添加诱导剂时相关参数的3.9倍和4.4倍。继续增加诱导剂添加时间，菌浓略有增加，但是酶活力显著降低。当诱导剂添加时间为10 h时，酶活力为16.0 U/mL，是最佳条件下酶活力的59.2%。

图5 诱导剂添加时间对重组菌生长、产酶的影响（A）和细胞破碎上清SDS-PAGE电泳图（B）Fig. 5 Effect of adding inducer at different times on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.5 共表达分子伴侣对产酶的影响

对带有重组载体pET24a-α-GPtm和不同分子伴侣 质 粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的共表达重组菌分别进行摇瓶发酵和诱导表达，结果显示5种分子伴侣共表达对α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表达水平均没有提高，因此后续研究以没有共表达分子伴侣的菌株为研究对象。

2.6 添加化学分子伴侣对重组菌生长及产酶的 影响

从2.2、2.3和2.4的结果可以看出，较低的诱导温度、适合的诱导强度及诱导时间对重组α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达水平具有明显的促进作用。此外，研究发现仍然有一定比例的重组α-葡聚糖磷酸化酶会以包涵体的形式存在，如果能够减少包涵体的形成，有望进一步提高α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表达水平。细胞内部天然存在的一些小分子渗透压调节剂不但能够显著地提高一些蛋白的热稳定性，而且可以促进蛋白的正确折叠。这些小分子渗透压调节剂由于具有提高天然蛋白的热稳定性和促进非折叠多肽复性的独特作用，而被称为“化学分子伴侣”。本研究根据文献报道，选择了8种试剂（苯乙醇、甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜碱、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇），考察它们对菌体生长及α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表达的影响。

如图6-A所示，添加10 mmol/L不同化学分子伴侣对菌体生长及α-葡聚糖磷酸化酶表达具有不同地影响。其中，苯乙醇对重组菌生长及产酶都有明显的抑制作用；甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜碱、L-脯氨酸对菌体生长有一定的促进作用；氧化三甲胺和肌醇对菌体生长影响不明显。在酶活力方面，苯乙醇、甘氨酸和海藻糖对酶活力有不同程度的抑制作用，其中海藻糖和苯乙醇抑制作用最为明显，酶活力只有对照组的28.0%和43.6%。苯甲醇、甜菜碱、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇对重组酶产量有不同程度的促进作用，其中氧化三甲胺和肌醇促进效果最佳，酶活力分别是对照酶活力的1.6倍和2.0倍。进一步研究发现，同时添加氧化三甲胺和肌醇，对重组酶的产量没有协同促进作用。

进一步考察了不同浓度肌醇（0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L和40 mmol/L）对重组菌发酵的影响。如图6-B所示，不同浓度肌醇对重组菌生长没有明显影响，但是对酶活力具有显著的影响。在0 mmol/L到20 mmol/L范围内，随着肌醇浓度的提高，酶活力逐渐提高，最高酶活力为58.8 U/mL，是不加肌醇时酶活力的2.6倍。当肌醇浓度大于20 mmol/L时，酶活力逐渐降低；肌醇浓度为30 mmol/L和40 mmol/L时，酶活力分别为57.8 U/mL和47.9 U/mL。因此最佳化学分子伴侣为肌醇，最佳浓度为20 mmol/L。

图6 化学分子伴侣种类（A）及肌醇浓度（B）对重组菌生长、产酶的影响Fig. 6 Effect of different chemical chaperone (A) and inositol concentration (B) on the recombinant strain growth and enzyme production

2.7 最优发酵条件下重组菌株生长及产酶曲线

在最佳培养及诱导条件下，将发酵时间延长到40 h，中间每隔一定时间取样测定重组菌株的发酵液细胞干重和重组酶活力，并绘制相应菌体生长和产酶曲线。如图7 所示，0-2 h为重组菌株生长延滞期；2-12 h为重组菌株对数生长期；重组菌株发酵25-30 h为生长稳定期；发酵30 h 以后进入衰亡期。酶活力增长趋势与菌体生长总体一致并略有滞后，酶活力在30 h 达到最高，为62.0 U/mL。

图7 重组菌在最佳条件下生长曲线和产酶曲线Fig. 7 Growth curve and enzyme production curve of recombinant strain on the optimal condition

3 讨论

α-葡聚糖磷酸化酶在葡萄糖-1-磷酸、合成直链淀粉及pH敏感水凝胶等高附加值产品的制备中具有广泛的应用价值。近年来国内外对该酶基因克隆表达、定性及应用评价等方面的报道逐年增 多［7，11-12］。但是，关于如何实现α-葡聚糖磷酸化酶高效发酵制备方面研究，国内外却鲜有报道。

研究发现，重组酶表达过程中，诱导条件[16-18]、除基因转录、翻译等会影响其表达量以外，不同类型酶自身特性（氨基酸组成、分子量大小、空间结构等）、宿主菌、培养表达条件等方面的差异亦会显著影响重组酶的折叠状态等，最终导致不同酶表现出在产量、可溶性比例等方面的巨大差异［19-21］。因此，重组菌株的构建只是获得重组酶的第一步。然而蛋白难以可溶性表达的情况时有发生，目前除了可以采用融合促溶标签［22-25］、蛋白质工程改造［26］、定向进化［27-28］等不同的策略来促进蛋白的正确折叠以提高其可溶表达水平以外，筛选与之匹配的培养表达条件也是促进蛋白可溶性表达的重要手段之 一［29-30］。本研究在构建产海栖热袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重组菌后，首先采用常规培养条件（培养温度为37℃，诱导剂浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导）进行诱导培养，酶活力检测结果显示酶活力仅为5.2 U/mL，SDS-PAGE蛋白电泳显示有较多的重组酶为不可溶的包涵体，说明该重组酶可溶性表达水平较低。为提高重组酶的可溶性表达水平，分别对诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间、共表达分子伴侣、添加化学分子伴侣等因素进行了优化。通过降低诱导强度（0.2 mmol/L IPTG）、诱导阶段低温培养（28℃），以及添加化学分子伴侣（20 mmol/L的肌醇），重组α-葡聚糖磷酸化酶的表达水平由5.2 U/mL提高到62.0 U/mL，可溶性酶的活力提高了11.9倍。该策略无需融合促溶标签，因此后续不用切割去除融合标签，下游处理工艺更加简单方便；此外，本方法亦无需对目的蛋白进行分子改造，因此可以最大限度的保持重组酶的天然结构，不会对酶的功能产生影响。该工艺的建立，显著提高了重组菌株发酵制备α-葡聚糖磷酸化酶的活力水平，为α-葡聚糖磷酸化酶进一步发酵放大奠定了基础，也可为其它蛋白的可溶性重组表达制备提供参考。

4 结论

本研究构建了产海栖热袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重组菌株，摇瓶培养发现该酶主要以包涵体形式存在，可溶性表达水平偏低。为减少包涵体的形成，提高重组酶可溶性表达水平，分别对诱导剂种类、诱导剂浓度、温度、诱导剂添加时间、分子伴侣、化学分子伴侣种类及浓度等因素对重组酶表达的影响进行了考察。优化后的最佳培养条件为：接种重组菌株的同时，向TB发酵培养基中添加终浓度为20 mmol/L的肌醇；然后在37℃条件下培养6 h，降温至28℃并加入0.2 mmol/L IPTG，继续诱导培养。发酵30 h 酶活力达到最高，为62.0 U/mL，是优化前酶活力的11.9倍。