广藿香百秋李醇分子调控及合成生物学研究进展

2021-09-14张婵姚广龙张军锋于靖杨东梅陈萍吴友根

生物技术通报 2021年8期

张婵姚广龙张军锋于靖杨东梅陈萍吴友根

（海南大学园艺学院，海口 571100）

广藿香（Pogostemon cablin）是一种药用芳香类草本植物，为首批“岭南地道药材保护品种”之一。其主要在印度尼西亚、新加坡、越南、马来西亚、中国等地区种植［1］。广藿香油是以广藿香干燥地上部分经蒸馏等方式加工而成［2］。广藿香油的作用主要有两类，一是其具备抑菌、消炎、止痛、抗抑郁、抗血小板、抗胃溃疡、抗光老化等17种药理功效［3-6］，可入药；二是其香味独特且定香功能显著，可作为香料和食品添加剂［7］。得益于其效用，广藿香油在日化用品、药品和食品等行业中被广泛应用，市场前景广阔［7-8］。优质的广藿香油价格可高达1 300元/kg，就零售价而言，其可在全球重要精油中排名第十，经济效益明显［9-10］。

百秋李醇（patchoulol）是一种倍半萜，为广藿香油中的含量最多的组分之一，于1869年以白色晶体形式被分离鉴定［7，11-12］。百秋李醇是《中国药典》中评价广藿香及其精油质量的重要指标，也被认为是广藿香油药理功效和香味的主要贡献成分［6］。目前，全球百秋李醇及其混合精油年产量约1 300 t，但年需求量可达2 000 t，供不应求。其中90%的产量由印度尼西亚供应，而中国的产量不到10%，上升空间极大［10，13］。提高百秋李醇的产量成为广藿香研究中的重点。为此，本文将从百秋李醇的合成途径、分子调控机制和合成生物学工程三方面综述近年来的相关研究进展。

1 百秋李醇生物合成途径及相关转录因子

1.1 生物合成途径

在广藿香中，与百秋李醇合成相关的途径主要有两条，一是定位于细胞质的甲羟戊酸（mevalonate，MVA）途径，二是定位于叶绿体的甲基赤藓糖-4-磷酸（methylerythritol-4-phosphate，MEP）途径，两者均可产生异戊烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），IPP可与DMAPP反应生成法呢基焦磷酸（farnesyl diphosphate，FPP）、牻牛儿基焦磷酸（geranyl diphosphate，GPP）和牻牛儿基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）等合成萜类化合物的直接前体物质［14］。一般情况下，百秋李醇主要是由MVA途径产生的FPP为前体合成的（图1）［15］。百秋李醇合成后有两条去路，一是以混合精油形式在广藿香花、根、茎、叶的特定细胞中存储［16］；二是以挥发物形式释放到外界环境。

在百秋李醇的合成中有6个关键酶（图1），分别为乙酰CoA酰基转移酶（PatAACT）、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶（PatHMGS）、3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶（PatHMGR）、异戊烯基焦磷酸异构酶（PatIPI）、法呢基焦磷酸合酶（PatFPS）和百秋李醇合酶（PatPTS）等，其中后4个酶已被克隆并进行了功能验证（表1）。唐云等［17］和卢昌化等［18］构建了pCAMBIA1304-PatFPS和pR101-PatPTS的双元表达载体发现，过表达PatFPS和PatPTS可促进百秋李醇的合成；Yan等［19］和Zhang等［20］分别构建了基因沉默载体pTRV2-PatIPI和过表达载体pCAMBIA1300-35S-PatHMGR发现，沉默PatIPI会显著降低百秋李醇含量，而过表达PatHMGR则使百秋李醇含量显著增多；以上研究表明PatHMGR、PatIPI、PatFPS和PatPTS参与百秋李醇的生物合成。

表1 广藿香百秋李醇合成途径中已经克隆的酶Table 1 Enzymes cloned in the synthetic pathway of patchoulol in P. cablin

1.2 相关转录因子

转录因子可影响酶基因表达的特异性、时空性和高效性，故其在百秋李醇的合成中也具有重要作用。转录因子是一种DNA结合蛋白，常与顺式元件结合以调控基因的表达。迄今，与百秋李醇生物合成调控相关的转录因子有6类，包括MYB家族（1个）、bHLH家族（2个）、SPL家族（1个）和TH家族（1个）。

MYB是植物中最大的转录因子家族，参与次生代谢产物合成调控；Chen等［27］发现定位于细胞核PatMYB46（PatSWC4），可与PatJAZ4结合调控PatPTS的表达，过表达PatMYB46可显著上调百秋李醇生物合成途径中所有酶基因的表达水平，从而提高百秋李醇的含量。MYC转录因子是bHLH家族中的一个亚类；Wang等［28］发现PatMYC2b1和PatMYC2b2均可与PatJAZ6结合影响PatPTS的表达水平，但该研究更侧重对PatJAZ6的研究，并没有对PatMYC2b1和PatMYC2b2的生物学特征进行系统分析。TH家族是与光反应调控相关一类转录因子；Li等［29］发现广藿香中的16个PatTH的组织表达模式有所不同，PaTH1，4，7，8，9，15在叶中表达最高，PatTH3和PatTH6则分别主要在茎和根中表达；进一步分析表明PatGT-1可与PatHMGR的启动子结合，抑制其表达；且在广藿香中过表达PatGT-1会抑制百秋李醇合成途径所有酶的表达，从而抑制百秋李醇的合成［29］。SPL是植物特有转录因子家族，其最大的特征是具备miRNA156/157识别位点，miRNA156/157可通过mRNA剪切或翻译抑制等作用，调控SPL基因的表达水平；Yu等［30］发现SPL10可调控广藿香中PatPTS的表达，以促进百秋李醇的合成，验证发现过表达SPL10（At1g27370）可显著提高百秋李醇的含量。此外，与广藿香相关还有WRKY家族；唐云等［31］克隆了PatWRKY40和PatWRKY53两个基因；其中PatWRKY40在广藿香中的表达具有组织表达差异性，在叶中表达量最高，其次为花和茎；但对于两者是否参与百秋李醇的合成调控还不清楚。

转录因子可激活特定代谢通路中多个基因的协同表达，改造转录因子提高药用植物中活性物质产量的方法，可弥补单个基因或多个基因改造后出现的效果不足、甚至致死的现象［32］。系统了解与百秋李醇生物合成相关酶及转录因子的作用，对提高广藿香中百秋李醇含量具有重要意义。

2 百秋李醇分子调控机制

百秋李醇本质上是一种倍半萜，其合成主要受两方面因素的调控，一是生物因素，包括发育阶段、组织特异性等；二是非生物因素，如外源植物激素、昼夜节律、温度和矿质因子等。本部分将重点介绍外源植物激素、发育阶段与昼夜节律等调控百秋李醇合成的分子机制。

2.1 外源植物激素调控百秋李醇合成

外源植物激素是人为施加，可在一定范围内促进或抑制植物生长发育等过程的有机化合物。在广藿香研究中涉及过5种植物激素［27］，包括茉莉酸类、脱落酸、乙烯、水杨酸和赤霉素，其中以茉莉酸类的研究最为深入。茉莉酸类物质（jasmonates，JAs）主要包括茉莉酸和茉莉酸甲酯（methyl-jasmonate，MeJA）等，在茉莉酸信号通路中作为信号分子发挥作用［33］。当外界胁迫发生后，JAs可迅速合成并转运至细胞核，与抑制子JAZ（jasmonate ZIM domain protein）和E3泛素化酶SCFCOI1组成的共接受子结合，引起JAZ蛋白的泛素化降解，释放与之结合的转录因子，从而激活或抑制次生代谢产物合成途径关键酶基因的表达［34］。

多项研究表明JAs可调控广藿香百秋李醇的生物合成。何梦玲等［35］率先发现MeJA可促进广藿香中百秋李醇的合成。Chen等［36］发现MeJA可上调PatHMGR1和PatHMGR2（MAV途径）、PatDXS和PatHDR（MEP途径）以及PatPTS等基因的表达。Tang等［14］发现以MeJA处理6 h，可显著上调PatATCC、PatHMGR、PatMVD、PatFPS等4个基因的表达水平，且百秋李醇的含量显著增多。但要注意，不同的处理时间产生的结果有差异。如Li等［30］以MeJA处理12 h后，会上调PatGT-1的表达水平。

JAZ蛋白通常作为茉莉酸信号通路中的抑制子，在JAs调控的百秋李醇合成中具有重要作用。Chen等［36］发现MeJA可显著上调PatJAZ2，3，4，6，11等5个基因的表达，或与百秋李醇的含量增多相关。Wang等［29］在广藿香中过表达PatJAZ6，可抑制PatPTS、PatMYC2b1、PatMYC2b2的表达；深入分析发现PatJAZ6可与PatMYC2b1或PatMYC2b2结合，负调控PatPTS的表达，而MeJA可与PatJAZ6结合，使其在SCFCOI1的作用下泛素化，随后被26S蛋白酶体降解，释放PatMYC2b1和PatMYC2b2，激活PatPTS的表达（图1）。近期，Chen等［27］发现PatJAZ4可与PatMYB46结合，负调控PatPTS的表达，而MeJA也可逆转其负调控效果（图1）。邓静文等［37］研究表明PatJAZ2是响应MeJA诱导百秋李醇合成的主要顺式元件，其可激活倍半萜合成途径PatFPS基因的协同表达，影响百秋李醇的合成情况。

图1 广藿香百秋李醇合成途径与分子调控模式图［27-30］Fig. 1 Synthetic pathway and molecular regulation model of patchoulo in P. cablin［27-30］

综上可知，植物激素MeJA调控百秋李醇的机制主要有两方面：一是调控百秋李醇合成途径PatHMGR、PatFPS、PatIPI等基因的表达，促进前体物质的合成，间接影响百秋李醇的合成；二是通过影响相应转录因子与抑制子的结合情况，调控PatPTS的表达，直接影响百秋李醇的合成。但以上研究中均以叶片中存储的百秋李醇作为实验指标，忽略了释放到环境中的百秋李醇，这或对已有结果造成一定的影响。

2.2 昼夜节律与发育阶段调控百秋李醇合成

广藿香百秋李醇的合成具有时间特异性，主要在两方面展现，一是昼夜节律性（短期），即在同一天的不同时刻产生的规律变化；二是发育阶段性（长期），即随不同生长时期而产生规律的变化。刘璐等［38］发现百秋李醇的合成受昼夜变化的影响，广藿香中百秋李醇的含量分别于00：00和12：00达到最低和最高；从00：00到06：00点，其含量先急剧上升后下降；从12：00到21：00点则相反。罗集鹏等［39］和Yu等［28］检测到广藿香叶片和茎中的百秋李醇含量会随着生长期推进而增加。

百秋李醇合成受发育阶段调控的现象，在不同组织中保守程度也有所差异。Quyang等［40］发现叶片中百秋李醇合成受发育阶段调控的现象，在中国和印度尼西亚两个品种之间是相对保守的，而茎中该现象在两个品种之间却有所变化，表明发育阶段调控的百秋李醇合成受品种和组织特异性的影响。SPL是调控植物生长转变的一类重要转录因子，Yu等［28］发现在广藿香中过表达SPL10（At1g27370）可显著提高百秋李醇的含量，而过表达miRNA156则相反（图1），这表明miRNA156与SPL转录因子参与百秋李醇的合成调控。miRNA156可抑制SPL的表达，这可能是出现过表达miRNA156和SPL10效果不同的原因。

综上，发育阶段和昼夜节律可调控广藿香百秋李醇的生物合成，且受栽培品种和组织特异性的影响，而miRNA156靶标的SPL10在发育阶段调控百秋李醇的生物合成中具有重要作用。但该研究中使用的SPL10是拟南芥At1g27370，对于广藿香中SPL转录因子在百秋李醇合成调控中的作用仍不清楚。

3 百秋李醇的合成生物学工程

百秋李醇的获取主要有两种方式，一是从广藿香中天然萃取，二是以合成生物学工程生产。植物提取法效率低、产量少、稳定性差，不能满足市场需求，合成生物学工程生产萜类化合物效率高、经济环保且供应稳定性好，成为了获取百秋李醇的热门手段。本部分将从以下3方面介绍近年来百秋李醇合成生物学的相关进展。

3.1 不同来源底盘细胞的构建

底盘细胞的构建是异源合成百秋李醇的第一步。底盘细胞是参照工程学理念置入特定功能的人工生物系统。迄今，可用于合成百秋李醇的底盘细胞有7种，包括微生物（酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、荚膜红螺菌）和植物（烟草、莱茵衣藻、小立碗藓、地钱）（表2）。

表2 用于合成百秋李醇的7种生物底盘Table 2 Seven biological chassis used to synthesize patchoulol

3.1.1 微生物来源的底盘细胞构建酿酒酵母是最早用来生产百秋李醇的底盘细胞，其构建策略主要可分为以下4方面［51］：一是过表达MVA途径关键酶，增加前体物质FPP的供应；二是替换基因元件的启动子，下调其他竞争通路；三是敲除负调控因子，抑制非目标产物；四是过表达百秋李醇合酶（PatPTS）。已有报道中，常同时采用上述多个策略构建底盘生产百秋李醇。Asadollahi等［44］将MET3替换角鲨烯合酶（ERG9）的启动子，减少FPP流向其他通路，却使法尼醇合成增多，以致百秋李醇产量提高不明显。Gruchattka等［42］敲除酿酒酵母丙酮酸脱氢酶旁路中的α-酮戊二酸脱氢酶，增加柠檬酸循环转向萜类的代谢通量，过表达FPS（ERG20）和tHMGR（源自酵母）后，百秋李醇产量提高明显，达41.6 mg/L。Ma等［9］首先将tHMGR、IPI和upc2-1整合到酵母基因组，增强MVA代谢通路；然后以HXT1弱化角鲨烯合酶（ERG9）的表达，敲除编码焦磷酸酶的DPP1和LPP1；并调整葡萄糖浓度以控制百秋李醇和角鲨烯代谢流，使百秋李醇产量达466.8 mg/L，是已有报道中最高的。

荚膜红螺菌和谷氨酸棒杆菌是合成百秋李醇的新型细菌底盘，二者没有MVA途径，因此必须重构法尼基焦磷酸合成模块，才能合成百秋李醇。Troost等［45］在Rhodobacter capsulatus SB1003中加入nifHDK操纵子的Pnif启动子，使重组表达模块仅在光照和铵耗竭的情况下被诱导；后构建包含1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP）模块，甲羟戊酸通路（MVA）模块（源自Paracoccus zeaxanthinifaciens）和异戊二烯基磷酸酯（IDI）模块（源自Rhodobacter sphaeroides）的工程菌Rhodobacter capsulatus SB1003-MAV，过表达3个模块中的限速酶DXS、IDI、IspA基因后，百秋李醇的产量被提高了126倍，该研究首次在细菌中建立可严格控制的光反应平台。crtE和idsA是谷氨酸棒杆菌GGPP的编码基因，Henke等［2］构建了ΔcrtEΔidsA谷氨酸棒杆菌，并重构法尼基焦磷酸合成模块，异源表达大肠杆菌的法尼基焦磷酸合酶基因（ispAEc）和PatPTS，百秋李醇产量达60 mg/L。谷氨酸棒杆菌和荚膜红螺菌主要是通过质粒驱动异源表达，尚未见将反应元件整合至DNA中的报道。

3.1.2 植物来源的底盘细胞构建烟草是最早用于合成百秋李醇的植物底盘，而莱茵衣藻、小立碗藓和地钱3种低等植物是合成百秋李醇的新型底盘，四者特点见表2。Wu等［46］将PatPTS和FPS在烟草叶绿体中靶向表达，率先实现以烟草合成百秋李醇，但该研究侧重的是提高烟草抗虫性，对以其生产百秋李醇方面并未深入研究。Lauersen等［47］使用核基因改造的新策略，在潮霉素抗性载体转基因的莱茵衣藻基础上，将3个拷贝（3X）PatPTS基因整合至DNA上，百秋李醇的产率是1XPatPTS核转基因底盘的4倍。Zhan等［49］率先在小立碗藓中非靶向表达PatPTS，过表达tHMGR（源自小立碗藓），百秋李醇产量达 59 μg/g CDW；小立碗藓仅含两个二萜合酶编码基因CPS/KS，但Zhan等［49］发现敲除CPS/KS并不能提高百秋李醇的合成。周璐等［50］分别将强启动子35S和CVM与FPS（源自地钱）和PatPTS连接，在地钱中共表达两个基因后，百秋李醇产量为655.21 μg/g CDW，是植物底盘中报道最高的。

植物底盘细胞具有调控系统精密、经济环保等特点，但以其为底盘生产百秋李醇的产量较低且提高幅度慢。目前，在微生物底盘中，酿酒酵母已可生产商用的百秋李醇，但该产品为瑞士Firmenich公司所拥有［52］；而在植物底盘中，地钱的潜力最大，但其产量仍未达到商业化的要求。

3.2 合成元件的设计和组装

合成元件的设计和组装是实现百秋李醇异源合成的第二步，该部分的研究内容可分为两方面：一是合成元件的设计，即基因元件密码子的优化。如Henke等［2］、Troost等［45］和Asadollahi等［44］均对PatPTS的密码子进行优化，使其能在谷氨酸棒杆菌、荚膜红螺菌和酿酒酵母中异源表达。Zhan等［49］在小立碗藓中，以35S启动子控制HMGR的表达。Mitsui等［41］以S. cerevisiae和Hansenula polymorpha中15个启动子等对MVA途径中的6个关键酶的启动子进行优化。二是设计合成元件组合模式，即优化不同基因元件的组合方式。如Lauersen等［47］在莱茵衣藻中共表达PatPTS和FPP、PatPTS和ispAEc、PatPTS和FPP，以PatPTS和ispAEc的表达效果最好。Wu等［46］比较了2tpPatPTS、2tpFPSPatPTS、2tpPatPTS-tpFPS靶向烟草叶绿体后百秋李醇的合成情况，效果最好的是2tpPatPTStpFPS。Troost等［45］评估了PatPTS-IspA、PatPTSDXS、PatPTS-idi、PatPTS-MVA、PatPTS-ispA-dxs、PatPTS-ispA-dxs-idi、PatPTS-ispA-dxs-idi-MVA等不同组合生产百秋李醇的效果，其中双基因组合PatPTSIspA和多基因组合PatPTS-ispA-dxs-idi的产量分别是对照的96倍和115倍，效果最佳。

3.3 合成反应的优化和提升

合成反应的优化和提升是实现百秋李醇异源生产的最后一步。目前，百秋李醇合成生物学工程中主要采用了4种优化策略。

3.3.1 关键酶基因元件的优化百秋李醇合成通路中具有多个关键酶基因，这些元件可通过基因替换、基因元件扩增、基因融合表达、基因簇整合及与耐药元件组合等方式进行优化。如Lauersen等［47］构建了PatPTS-CFP（mCerulean3抗性基因）和PatPTS-YFP（黄色荧光蛋白）的双重表达系统，使百秋李醇产量增加了3倍；此外，其还在莱茵衣藻中表达了3XPatPTS的融合载体，使产量提高4倍［47］。

3.3.2 增加前体底物FPP的供应量 FPP可合成百秋李醇、角鲨烯或法呢醇，抑制FPP的其他代谢通路，可增加其流向百秋李醇的总量。Asadollahi等［44］抑制角鲨烯合酶编码基因ERG9的表达后，百秋李醇的产量增多。Henke等［2］敲除idsA和crtE，减少DMAPP合成GGPP，促进百秋李醇的合成。

3.3.3 引入亚细胞靶向表达 MVA和MEP途径分别在细胞质和叶绿体形成不同的萜类前体池，对基因元件的靶向表达，可提高FPP的利用效率。如周璐等［50］分别在FPS和PatPTS的5'端加入RUBISCO蛋白的转运肽信号序列，使其在地钱叶绿体中靶向表达，百秋李醇的产量显著增加。Peramuna等［48］在小碗立藓中，构建了3种细胞质脂质滴蛋白基因与PatPTS共表达的底盘，发现脂质定位表达的细胞中百秋李醇的保留量得到显著提高，但百秋李醇的产量并未增加。目前，靶向表达的策略主要针植物底盘，在微生物底盘中开展较少。

3.3.4 培养条件优化优化发酵方式和培养基组成，均可提升百秋李醇的产量。Henke等［2］发现分批补料发酵比的震荡培养效果更好。Lauersen等［47］发现莱茵衣藻利用不同碳源生产百秋李醇效果不同，以CO2、乙酸盐、CO2加乙酸盐为唯一碳源时，百秋李醇浓度分别为351 μg/L、363 μg/L以及435 μg/L，同时添加CO2和乙酸盐的效果最佳。

4 展望

广藿香中百秋李醇含量低，是限制其规模化开发与利用的关键。利用合成生物学工程生产百秋李醇，不受环境和土地面积的制约，可稳定百秋李醇的价格及供应情况，农业应用价值高；而了解百秋李醇合成途径及分子调控机制，可为合成生物学工程的开展奠定基础；双管齐下，才有望解决百秋李醇供不应求的问题。结合当前研究现状，对未来研究方向提出以下几点建议。