不同食用菌多糖复配物对RAW264.7 巨噬细胞的免疫调节作用

谌淑平，李明智，董 楠，徐德昌，陈晓敏，胡婕伦，钟虹光，尧梅香，聂少平,*

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，中加食品科学技术联合实验室(南昌)，江西南昌 330047；2.江中食疗科技有限公司，江西九江 330000）

机体的免疫系统由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成，被分为天然免疫系统和适应性免疫系统，是人体重要的防御屏障[1]。正常的免疫反应可以通过对抗病原体并清除自身衰老、恶化、突变或死亡的细胞来维持机体的健康[2]。机体免疫系统的失调与机体的病理密切相关，例如过敏、炎症、癌症和肿瘤等[3]。

随着人们健康意识的提高，食疗已经成为社会关注的焦点。作为一类重要的“食药同源”食材，食用菌在我国膳食食谱中占有重要的一席[4]。食用菌具有改善血液微循环、降低胆固醇和提高肝脏解毒能力等活性作用。长期食用食用菌具有促进机体的新陈代谢、增强机体免疫等益处[5]，可达到较好的食疗效果。多糖作为食用菌主要的有效成分之一，可通过刺激效应巨噬细胞而分泌细胞因子，进而调节机体免疫系统和相关免疫通路[6]。最新研究报道表明，大部分的食用菌多糖在免疫调节、降血糖、降血脂、抗癌和护肝等方面具有显著效果[7]。如银耳、茯苓、香菇、猴头菇和竹荪作为食用菌，是人们餐桌的常客。这些食用菌中的多糖组分均已被证实能很好地调节机体免疫[8−15]。食用菌多糖资源丰富，并具有良好的免疫调节活性，在开发增强机体免疫功能的产品方面具有明显优势。

目前，国内外对食用菌多糖的免疫调节活性大多基于某种多糖单独作用的研究，对多糖复配物的免疫调节活性研究报道较少。食用菌多糖作为极具潜力的天然产物，探究不同食用菌多糖复配物的免疫调节活性，最大限度地发挥食用菌多糖的生物活性，拥有广阔的开发前景。巨噬细胞是天然免疫系统中最重要的免疫细胞之一，它的活化被认为是刺激免疫系统的必要步骤[16]。本研究团队前期初步发现5 种常见食用菌多糖（银耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴头菇多糖和竹荪多糖）单独作用于RAW264.7 时具有免疫调节活性，然而，这几种食用菌进行复配后的免疫调节活性目前尚不清楚。因此，本实验以巨噬细胞RAW264.7 为研究对象，探讨5 种食用菌多糖中任意3 种进行复配得到的多糖复配物的免疫调节活性，实验结果可丰富食用菌多糖的研究结果，也可为后期探究多糖复配物免疫调节活性机制提供参考数据，也为基于多糖复配物开发免疫调节功能食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

猴头菇多糖、银耳多糖 由江中食疗科技有限公司哆糖君研究组提供；香菇多糖、茯苓多糖、竹荪多糖 由南昌大学食品科学与技术国家重点实验室制备。以葡萄糖为标准品，苯酚-硫酸法检测，猴头菇多糖、银耳多糖、香菇多糖、茯苓多糖和竹荪多糖的多糖含量分别为92.97%、77.29%、71.00%、88.77%和95.25%；小鼠巨噬细胞RAW264.7 中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；DMEM 培养基、PBS 片剂 北京索莱宝公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） Biological Industries（BI）公司；FITC-dextran 美国Sigma 公司；LPS 上海碧云天生物技术有限公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒 武汉博士德公司；CCK-8 试剂盒 日本同仁公司。

Varioskan Flash 酶标仪、3110 Series II CO2培养箱 美国Thermo 公司；3K15-高速冷冻离心机 德国Sigma 公司；CKX41 倒置显微镜 日本Olympus公司；CytoFLEX S 流式细胞仪 美国Buckman Coulter 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 多糖复配物溶液的配制 培养基作溶剂，将5 种食用菌多糖均配制为浓度为320 μg/mL 的母液，任意3 种多糖按照1:1:1 的复配比配成多糖复配物溶液。然后由母液分别稀释成160、80、40、20、10 和5 μg/mL 的溶液备用，复配方式如表1。

表1 食用菌多糖复配方式Table 1 Compound methods of edible fungi polysaccharides

1.2.2 细胞培养与分组 RAW264.7 巨噬细胞用含有10%（mL/mL）胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 链霉素的DMEM 培养基在37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养，当细胞铺满培养瓶底部80%时进行传代。选取对数生长期细胞进行实验，主要分为正常对照组，加入DMEM 培养基；阳性组，加入1 μg/mL 的LPS 培养基溶液共培养[16]；样品组，加入不同浓度的多糖复配物培养基溶液处理。

1.2.3 增殖能力检测 取对数生长期的RAW264.7细胞接种于96 孔板中，接种密度为1×105个/mL，每孔100 μL，37 ℃培养4～12 h 后弃去培养液。按照分组，正常组加入100 μL 含10%胎牛血清的培养基，阳性组加入100 μL 含1 μg/mL LPS 的10%胎牛血清培养基，样品组加入100 μL 含不同复配多糖的10%胎牛血清培养基，多糖复配物最终浓度为5、10、20、40、80、160 和320 μg/mL，另设只含培养基不含细胞的孔为阴性对照组。培养24 h 后弃去上清，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 的培养液。培养1～4 h 后用酶标仪在450 nm 处测定吸光度[17]。细胞增殖率按式（1）计算：

式中，A0为阴性对照组吸光度，A1为正常对照组吸光度，A2为样品组或阳性组吸光度。

通过对增殖率的计算，分析不同浓度多糖复配物溶液对RAW264.7 巨噬细胞存活率的影响，从而进一步确定样品的浓度范围。

1.2.4 TNF-α含量检测 取对数生长期的RAW264.7细胞按每孔5×105个/mL 接种于24 孔板中，每孔500 μL，37 ℃培养4 h 后弃去培养液。按照分组，正常对照组中加入500 μL 含10%胎牛血清培养基溶液，阳性组加入500 μL 浓度为1 μg/mL LPS 的含10%胎牛血清培养基溶液，样品组加入500 μL 不同浓度的多糖复配物的10%胎牛血清培养基溶液，多糖复配物的最终浓度为5、10、20、40、80 和160 μg/mL。培养12 h 后，收集上清液，ELISA 法测定TNF-α含量[18]。

1.2.5 细胞吞噬能力测定 参考文献方法[19]，稍作修改，具体操作如下：将2 mL 细胞浓度为5×105个/mL的RAW264.7 巨噬细胞接种于6 孔细胞培养板中，于培养箱（37 ℃、5%CO2）中培养4 h 后洗去未贴壁细胞。按照分组，正常对照组每孔分别加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM 培养基，阳性组加入1 mL 1 μg/mL LPS 的10%胎牛血清培养基溶液，以及样品组分别加入1 mL 浓度为40、80 和160 μg/mL 的不同复配多糖的10%胎牛血清培养基溶液。培养24 h 后弃上清，PBS 清洗2 次，各孔分别加入1 mL浓度为1 mg/mL FITC-dextran 培养基溶液，37 ℃孵育1 h，用冷PBS 中止反应，细胞清洗2 次，收集细胞于1.5 mL 的EP 管中，1000 r/min 离心5 min，弃去上清。向收集到的细胞中加入0.5 mL PBS 重悬，流式细胞仪检测分析。

1.3 数据分析

实验数据以mean±SD 表示，采用SPSS 20.0 统计学软件进行单因素方差分析，利用Graph Pad 6.0 软件对实验结果进行作图分析。P<0.05 时有显著性差异，P<0.01 时有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW264.7增殖能力的影响

巨噬细胞体外增殖能力的检测是评价巨噬细胞免疫调节功能的常用方法[20]。如图1 所示，与正常对照组相比，除了320 μg/mL 的复配多糖308、309 和310 外，其他不同浓度复配多糖均可以显著促进巨噬细胞RAW264.7 的增殖（P<0.05，P<0.01），且每个复配多糖最佳剂量的效果都优于阳性LPS 组。除了复配多糖306（图1f），其他复配方式的多糖复配物最高剂量320 μg/mL 的效果均最差，这个结果与之前报道的高浓度的广叶绣球菌β-D-葡聚糖抑制RAW264.7 增殖的结果相似[21]，推测可能是高浓度的多糖复配物溶液渗透压较高，引起巨噬细胞活性抑制，也可能是多糖诱导巨噬细胞过度活化，功能紊乱。复配多糖303 促进巨噬细胞增殖效果强于其他复配多糖（图1c），浓度为10 μg/mL 时效果最好。综合目前已有报道，促进巨噬细胞增殖是多糖刺激巨噬细胞途径之一[22−23]。本实验结果表明，5 种食用菌多糖的任意3 种进行复配得到的多糖复配物均可显著刺激巨噬细胞RAW264.7 的增殖（P<0.05），从而提高巨噬细胞的免疫功能。

图1 不同食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW264.7 增殖能力的影响Fig.1 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the proliferation of macrophage RAW264.7

2.2 不同食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW264.7分泌TNF-α 能力的影响

激活的巨噬细胞可产生多种细胞因子来调节细胞和体液免疫反应，如TNF-α、IL-2 和IFN-γ[24]。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α是自身免疫性疾病中重要的炎症介质，能够活化T 细胞，并介导中性粒细胞聚集，刺激吞噬行为的产生，也会影响活化的巨噬细胞分泌IL-6 和IL-8 等炎症因子[25−26]。因此，本研究中选定其作为评价的代表性重要指标。另外根据对巨噬细胞RAW264.7 增殖率的测定，确定了检测多糖复配物的浓度为5、10、20、40、80 和160 μg/mL 对TNF-α分泌水平的影响。表2 为不同浓度的多糖复配物对RAW264.7 细胞分泌TNF-α的结果。结果表明，空白对照组巨噬细胞RAW264.7 的培养液中几乎不含细胞因子TNFα（0.079±0.037 ng/mL），而 阳 性LPS 组（13.790±3.999 ng/mL）和不同浓度的复配多糖溶液处理后的细胞培养液中TNF-α含量极显著升高（P<0.01）。此结果与之前报道的5 种食用菌多糖均能显著促进RAW264.7 分泌TNF-α[27]一致。所有复配多糖的最优剂量促进RAW264.7细胞分泌TNF-α的效果均强于阳性LPS。此结果表明复配多糖溶液能促进TNF-α的分泌。此外，复配多糖304、复配多糖305和复配多糖306 这3 种多糖复配物皆剂量依赖性促进RAW264.7 细胞分泌TNF-α。其中，160 μg/mL的复配多糖301 和10 μg/mL 的复配多糖303 处理的RAW264.7 细胞的培养液中TNF-α含量最高，分别为76.520±9.102、75.180±12.600 ng/mL。表明10 种多糖复配物均可以显著激活RAW264.7 细胞，使其TNF-α的分泌量显著增加，160 μg/mL 的复配多糖301 和10 μg/mL 的复配多糖303 的促进效果最强。

表2 不同种食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW264.7 分泌TNF-α 能力的影响Table 2 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the levels of TNF-α secreted by macrophage RAW264.7

2.3 不同种食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的影响

巨噬细胞的吞噬功能是机体防卫外来异物侵入的主要机制之一，可直接或间接地体现巨噬细胞的免疫应答能力[28−30]。本研究采用流式细胞仪检测巨噬细胞RAW264.7 吞噬FITC-dextran 评价细胞的吞噬能力[31]。分析不同浓度的复配多糖对RAW264.7增殖能力和TNF-α分泌量影响的检测结果发现，在浓度为40、80 和160 μg/mL 时，复配多糖促进RAW 264.7 的增殖和TNF-α的分泌具有显著性和稳定性。因此本实验选定这3 个浓度作为检测复配多糖对RAW264.7 吞噬能力影响的检测浓度。图2 展示的是不同食用菌多糖复配物对巨噬细胞RAW 264.7 吞噬FITC-dextran 的平均荧光强度的影响。与正常对照组相比，不同浓度的复配多糖均能极显著增加RAW 264.7 吞噬的FITC-dextran 的平均荧光强度（P<0.01），表明不同浓度的复配多糖均能极显著增强巨噬细胞的吞噬能力（P<0.01）。有研究通过流式细胞仪检测食用菌喇叭菌多糖处理后巨噬细胞吞噬的FITC-dextran 平均荧光强度发现喇叭菌多糖显著增强RAW264.7 的吞噬能力[32]，这与本实验的结果一致。除复配多糖303、复配多糖304、复配多糖306 和复配多糖309 这4 种复配物外，其他6 种复配物增强巨噬细胞的吞噬能力均呈现剂量依赖性。10 种复配方式中，复配多糖301（银耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖）增强巨噬细胞吞噬能力的效果最好，且浓度为160 μg/mL 时的促进效果（149350±2071）强于阳性LPS 组（116978±4233）。实验结果表明，40、80 和160 μg/mL 的多糖复配物均能极显著增强巨噬细胞RAW264.7 的吞噬能力（P<0.01）。

图2 不同食用菌多糖的复配物对巨噬细胞RAW264.7 吞噬能力的影响Fig.2 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the phagocytic ability of macrophage RAW264.7

3 结论

基于5 种食用菌多糖（银耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴头菇多糖和竹荪多糖）中的任意3 种多糖复配得到的10 种多糖复配物可通过促进巨噬细胞RAW264.7 的增殖、TNF-α的分泌以及增强巨噬细胞吞噬能力来实现免疫调节作用。其中基于银耳多糖、茯苓多糖和竹荪多糖的复配多糖303 促进巨噬细胞增殖的效果最好，基于银耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖的复配多糖301 以及基于银耳多糖、茯苓多糖和竹荪多糖的复配多糖303 在提高TNF-α分泌水平上效果最好，基于银耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖的复配多糖301 增强巨噬细胞的吞噬能力呈现了最强的效果。本研究结果可为以后深入研究不同食用菌多糖复配物的免疫调节机制奠定基础，也可为开发不同食用菌多糖复配物的相关健康产品提供理论依据。