甜菜碱对大鼠肝癌的作用及其抗氧化机制研究

杜艳平，区俊文，王军花，习文韬，唐艳辉

广东祈福医院营养科，广东广州510000

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)简称肝癌，严重威胁我国居民身体健康，是我国排名第四位的常见恶性肿瘤。肝癌死亡率高，在我国恶性肿瘤中死亡顺位仅次于胃癌和食道癌而居第三位[1]。肝癌的形成是一个多因素的复杂过程，发病过程隐匿，不利于早期防治。

甜菜碱(Betaine)是季胺盐型水溶性生物碱，具有多种生物学功能，可以降低毒物所导致的肝脏毒性，改善肝脏脂质过氧化状态，对肝脏起到保护作用，这在一定程度上可减弱外来化合物诱发肝癌的效应[2-4]。为探讨甜菜碱在肝癌发生过程的作用，本研究以Sprague-Dawley(SD)大鼠为研究对象，二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠产生肝癌，并用不同剂量的甜菜碱进行干预，以观察甜菜碱对肝癌形成的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物受试物及试剂甜菜碱(纯度＞96%)，购自Finnfeeds Finland Ltd(芬兰)公司；DEN(纯度＞95%)，购自Sigma公司；血清肝功能相关酶所用试剂购自中生北控生物技术股份有限公司；肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标所用试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 实验动物及处理44只SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(150±10)g，购自广东省医学动物实验中心(合格证号：0015571)。适应环境3 d后进入实验，将大鼠按照体质量编号后采用完全随机与分层随机相结合的方法分为三个组：正常组12只、DEN组18只、DEN+1%甜菜碱组(DEN+1%Bet组)14只。正常组、DEN组给予AIN-93G基础饲料，在基础饲料基础上，甜菜碱干预剂量参考既往研究，DEN+1%Bet组添加1%甜菜碱。所有大鼠代谢笼饲养，自由摄食饮水，除正常组外，另外两个组均给予0.01%DEN水置于避光饮水瓶中任其自由饮用。在实验第8周，各组随机选取5只大鼠，股动脉取血后脱臼处死，取肝、脾、肺、肾，称重后-80℃保存，计算脏器指数(脏器重量与其体质量之比值，g/100 g)。DEN组在实验第14周和15周各随机选取2只大鼠处死以观察肝癌形成情况，第15周末肝癌出现时处死各组所有大鼠。

1.3 指标测定

1.3.1 肝脏病理切片的制备对已发生肝癌的大鼠取肝结节及周围组织，没发生肝癌大鼠取右1/4肝上叶，10%中性福尔马林固定，经脱水、透明、浸蜡、常规石蜡包埋、制备成5 μm左右的切片，苏木素伊红(HE)染色，进行常规组织学检查。

1.3.2 血清肝功能相关酶测定全自动生化分析仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)。

1.3.3 肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标的测定称取0.5 g肝脏，转移至预冷的玻璃匀浆器中，加9倍(4.5 mL)冰冷的生理盐水，冰上将肝脏研磨至10%匀浆，4 000×g离心20 min，取上清，分装后-20℃保存待测。按试剂盒方法分别测定丙二醛(MDA)含量、谷胱苷肽硫转移酶(GST)、超氧化物歧化酶(SOD)酶活性、以及总抗氧化能力(T-AOC)，考马斯亮蓝法测定肝匀浆蛋白质含量。

1.4 统计学方法应用SPSS22.0软件进行数据统计分析，计量资料符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验。不符合正态分布的计量资料，以中位数[M(P25，P75)]表示，采用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般状况给予DEN的两个组大鼠从第2周开始体质量低于正常组；第4周之后逐渐出现被毛蓬松污秽、毛色黯淡，眼睛无神，精神萎靡，拱背等变化；DEN+1%Bet组上述症状比DEN组轻。DEN+1%Bet组第15周有一只大鼠死亡，解剖发现肝癌结节有破裂。从第2周开始DEN组、DEN+1%Bet组体质量低于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而DEN组、DEN+1%Bet组体质量比较差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1。

图1 各组大鼠体质量变化曲线图

2.2 各组大鼠不同时间的脏器指数比较DEN组在第8周及第15周均有多个脏器指数升高，而DEN+1%Bet组只在第8周出现肺脏指数升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 各组大鼠不同时间的脏器指数比较(±s，g/100 g)

表1 各组大鼠不同时间的脏器指数比较(±s，g/100 g)

注：与正常组比较，aP＜0.05。

时间8周15周组别正常组DEN组DEN+1%Bet组F值P值正常组DEN组DEN+1%Bet组F值P值例数5 5 5 7 9 8肝脏指数2.530±0.191 2.519±0.094 2.204±0.193 2.292 0.144 2.148±0.180 3.506±0.511a 2.485±0.444 13.59 0.001脾脏指数0.150±0.032 0.206±0.035 0.202±0.044 3.561 0.061 0.157±0.024 0.219±0.035a 0.184±0.024 5.670 0.018肺脏指数0.416±0.038 0.836±0.206a 0.854±0.291a 7.926 0.006 0.371±0.103 1.417±0.907a 0.734±0.251 15.33 0.001肾脏指数0.650±0.021 0.789±0.161a 0.612±0.027 12.56 0.001 0.551±0.024 0.614±0.107 0.584±0.026 0.308 0.740

2.3 各组大鼠肝脏形态学观察大体观见图2。第8周DEN+1%Bet组肝脏肉眼观无明显变化，DEN组肝脏肿大，表面粗糙暗淡、部分可见灰白色点状斑点；第15周给予DEN的两个组所有大鼠均有灰白色或灰黄色结节出现，但结节病变程度并不相同，DEN组肝脏多出现弥漫性大结节(直径多为5 mm左右)，DEN+1%Bet组结节较小(直径1 mm左右)、个数也比DEN组少。镜下观见图3。第8周DEN+1%Bet组肝细胞结构轻微破坏，出现部分肝细胞肥大增生、少量空泡变性；DEN组肝细胞明显空泡变性，局灶性坏死，纤维组织增生。第15周DEN+1%Bet组肝细胞核增大，染色质深染，呈现不典型增生；DEN组肝小叶结构完全破坏，结节内肝细胞异型性增生明显，胞质染色不均匀，核大，核仁清楚，核分裂像多见。

图2 大鼠肝脏大体观

图3 大鼠肝脏镜下观(10×40倍)

2.4甜菜碱在DEN致大鼠肝癌过程中对血清肝功能相关酶的影响由表2可知，DEN组无论在第8周还是第15周，ALT、AST、ALP、GGT均高于正常组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；第8周，DEN+1% Bet组大鼠ALP和GGT均高于正常组，而AST却低于DEN组，差异均有统计学意义(P＜0.05)；第15周，DEN+1%Bet组ALT、ALP、GGT均高于正常组，而ALT、AST却低于DEN组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组大鼠血清肝功能相关酶含量比较[±s，M(P25，P75)，U/L]

表2 各组大鼠血清肝功能相关酶含量比较[±s，M(P25，P75)，U/L]

注：与正常组比较，aP＜0.05；与DEN组比较，bP＜0.05。

时间8周15周组别正常组DEN组DEN+1%Bet组F/H值P值正常组DEN组DEN+1%Bet组F/H值P值例数5 5 5 7 9 8 ALT 24.00±2.12 37.50±1.91a 30.80±4.32 4.064 0.045 28.50±3.08 60.14±11.47a 41.33±4.55ab 39.46 0.001 AST 197.60±12.09 247.00±15.16a 196.00±11.87b 5.700 0.018 215.17±17.88 291.00±24.48a 235.33±19.12b 4.918 0.028 ALP 120.80±10.47 219.50±22.28a 210.60±19.60a 41.13 0.001 126.67±15.86 232.86±14.33a 233.67±19.15a 19.16 0.001 GGT 33(25，44.5)102(75，219)a 79(62.5，140)a 9.62 0.008 41(29，52)148(119，260)a 146(107，314.5)a 9.38 0.009

2.5 甜菜碱在DEN致大鼠肝癌过程中对肝脏脂质过氧化及抗氧化功能的影响由表3可知，第8周，DEN组MDA含量、GST酶活性、及T-AOC水平均高于正常组，而DEN+1%Bet组MDA含量低于DEN组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。第15周，各组间各指标比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表3 各组大鼠肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标[±s，M(P25，P75)]

表3 各组大鼠肝匀浆脂质过氧化及抗氧化指标[±s，M(P25，P75)]

注：与正常组比较，aP＜0.05；与DEN组比较，bP＜0.05。

时间8周15周组别正常组DEN组DEN+1%Bet组F/H值P值正常组DEN组DEN+1%Bet组F/H值P值例数5 5 5 7 9 8 MDA含量(nmol/mg·prot)0.166±0.055 0.357±0.152a 0.145±0.068b 20.18 0.001 0.236±0.088 0.299±0.087 0.222±0.032 2.799 0.101 SOD酶活性(U/mg·prot)163.3(152.2，191.4)166.5(134.1，195.1)188.6(155.3，227.6)1.22 0.543 155.6(141.4，200.1)151.4(128.9，171.5)155.3(138.7，188.2)0.980 0.613 GST酶活性(U/mg·prot)27.37±2.63 38.62±2.55a 31.36±3.10 8.16 0.006 27.79±6.73 29.29±4.23 26.41±3.46 0.152 0.861 T-AOC(U/mg·prot)0.293(0.208，0.319)0.585(0.481，0.749)a 0.505(0.383，0.655)8.85 0.012 0.301(0.185，0.581)0.992(0.601，1.183)0.405(0.298，0.909)5.325 0.07

3 讨论

DEN是一种对动物有较强致癌作用的化学物，在自然界中广泛存在，在机体内代谢时发挥其致癌作用。经口摄入DEN可导致严重的肝损伤，并最终形成肝癌，与人类肝癌有相似的发病轨迹[5]。本研究以0.01% DEN通过长期饮水法诱发大鼠肝脏癌变。第15周实验结束时，经病理检查证实模型组全部出现肝癌，说明造模成功。肝癌形成之后，肝结节的破裂易导致大鼠死亡，第15周DEN+1% Bet组死亡1只大鼠。DEN在诱导大鼠肝癌形成过程中，肝细胞遭到严重破坏，导致DEN组血清ALT、AST、ALP、GGT均显著升高，这与以往的研究结果相一致[6]。

甜菜碱是甘氨酸的三甲基衍生物，主要通过食物摄入，对肝脏具有一定的保护作用，可减弱酒精、脂多糖、四氯化碳等所导致的肝脏毒性[2]。越来越多证据表明，甜菜碱可能对癌症有保护作用，甜菜碱的摄入可降低癌症发病率，但需要进一步的研究来验证这一结果[7]。本研究结果显示，DEN+1%Bet组大鼠第8周AST低于DEN组，第15周ALT、AST均低于DEN组，这提示1%甜菜碱对DEN引起的肝脏损伤起到一定的保护作用。

有证据表明，甜菜碱在多种疾病中具有抗炎作用，可改善含硫氨基酸的代谢来应对机体的脂质过氧化[7]。机体正常代谢过程中能够维持体内脂质过氧化和抗氧化系统的动态平衡，当机体处于病理状态时，平衡被破坏，过多的自由基堆积并夺取细胞膜不饱和脂肪酸侧链上的氢原子而启动脂质过氧化链式反应，产生过多的MDA等醛类代谢产物而损伤细胞结构，引起蛋白质交联变性、DNA损伤而促进肿瘤的形成[8]。研究发现，甜菜碱可减少MDA等脂质过氧化物，并提高SOD、GST等抗氧化产物浓度，以减少DEN对肝脏的损伤[3-4]。本研究的第8周，DEN+1%Bet组MDA含量低于DEN组，提示1%甜菜碱可减少体内脂质过氧化产物以减轻DEN对肝脏所致的损伤，在DEN诱发大鼠肝癌的过程中起到保护肝脏的作用。

GST是一类与解毒功能有关的酶，当机体受到DEN等化学致癌物的影响时，GST酶活性代偿性增高，以此来代谢化学致癌物。肝脏癌前病变时肝细胞膜的通透性增加，GST释放到肝细胞外，导致肝匀浆中GST浓度增多、酶活性升高[9]。第8周的实验结果提示在一定程度上，肝匀浆中GST酶活性升高情况与肝脏损伤状况有关。T-AOC测定组织中各种抗氧化物质和抗氧化酶等构成的总抗氧化水平，在本研究中，可反映肝脏的总抗氧化能力，第8周，DEN组T-AOC水平高于正常组，这提示在DEN诱导肝癌早期，肝脏在受损过程中，增强了代偿能力，以减少有毒物质对肝脏的影响。SOD是机体清除自由基，降低脂质过氧化反应的主要酶系，但在本研究中，各组间SOD的比较均无统计学意义，还需进一步探明原因。

第15周，各组间MDA、SOD、GST和T-AOC比较差异无统计学意义，这提示脂质过氧化与抗氧化系统失衡在肝癌发生早期起重要作用，但随着癌变程度的加重，DEN破坏了肝脏的抗氧化系统，也损伤了肝脏的代谢能力，甜菜碱不能在肝脏充分代谢以发挥其抗脂质过氧化作用，这可能是第15周甜菜碱不能改善肝脏抗氧化能力的原因，具体机制还有待于更深入的研究。

本研究通过成功运用DEN诱发大鼠肝癌模型，重点从甜菜碱的抗氧化功能探讨了其在大鼠肝癌发生过程中的作用及机制。结果表明，在肝癌发生早期，1%甜菜碱具有抗脂质过氧化的作用，能够减弱DEN对大鼠肝脏的损伤，在DEN致大鼠肝癌过程中起到一定的保护作用。但由于试剂盒检测过程中，影响因素太多，灵敏性较差，还需要采用更灵敏的检测手段进一步验证。此外，甜菜碱作为高效的甲基供体，在调节基因甲基化过程中发挥重要作用，因此，我们拟检测甜菜碱在预防肝癌发生过程中对基因甲基化的作用，进一步探讨其作用机制。