防风提取物通过5-羟色胺信号轴对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠黏膜肥大细胞的影响

2021-09-13张秉丽霍成英李有连朱海宏

浙江中医药大学学报 2021年8期

张秉丽霍成英李有连朱海宏

1.青海仁济医院西宁 810000 2.青海省人民医院

肠易激综合征是一种常见的消化系统疾病，可分为便秘型、腹泻型、混合型、未定型等多种类型，其中腹泻型最常见，可引发腹痛、腹部不适、排便习惯改变等症状，影响患者生活质量[1]。研究发现，结肠黏膜肥大细胞数量增多、功能激活在腹泻型肠易激综合征发生、发展中具有重要作用，可引发细胞损伤、炎症反应[2-3]。防风为传统中药材，其成分多糖、挥发油、色原酮等具有一定抗氧化活性，且可减轻炎症反应，缓解胃肠道功能紊乱[4-5]，但目前关于防风提取物对腹泻型肠易激综合征患者结肠黏膜肥大细胞的影响及具体机制仍无定论。研究证实，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）可参与脑-肠轴功能调节，在肠易激综合征发生中有重要作用[6]。本研究拟开展动物实验，分析防风提取物对腹泻型肠易激综合征大鼠结肠黏膜肥大细胞的影响，并着重探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物健康雄性清洁级SD新生期大鼠60只，1d龄，体质量4.80～5.50g；清洁级SD哺乳期母鼠60只，7周龄，体质量260～280g，均购于中国医药研究开发中心有限公司[实验动物使用许可证号码：SYXK（京）2018-0030]，产地为中国医学科学院医学实验动物研究所[实验动物生产许可证号码：SCXK（京）2019-0011]，饲养于青海大学[实验动物使用许可证号码：SYXK（青）2020-0001]。所有大鼠实验前适应性喂养3d，室温（22±2）℃，相对湿度45%～60%，光照周期12h/12h，自由饮水、进食。本研究经动物伦理委员会审核批准（批准号：IACUC-2019-005）。

1.2 药物、试剂和仪器防风购于北京同仁堂股份有限公司（批号：180214）；昂丹司琼（纯度＞98%）购于美国LGM Pharma公司（批号：200418）；苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒购于碧云天生物技术有限公司（批号：151123）；二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）蛋白试剂盒购于湖北武汉富鑫远科技有限公司（批号：200316）；甲苯胺蓝染色试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司（批号：190517）；5-HT、5-HT3受体（5-HT3 receptor，5-HT3R）、5-HT4受体（5-HT4 receptor，5-HT4R）、色氨酸羟化酶1（tryptophan hydroxylase 1，TPH1）酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒均购于上海将来实业股份有限公司（批号：180521、181206、190411、170414）；兔抗大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1一抗及山羊抗兔IgG二抗均购于英国Abcam公司（批号：180507、120516、150417、180223）。 DG5031型酶联免疫酶标仪购于华东电子医疗公司；MIQAS型医学图像定量分析系统及软件为上海求为生物科技有限公司产品；BX51型显微镜购于日本奥林巴斯株式会社。

1.3 模型制备及分组在60只新生期大鼠中随机选10只作为A组（空白对照组），其余50只新生期大鼠建立腹泻型肠易激综合征大鼠模型[7]，具体如下：第2～21日龄期间，每日上午8:00～11:00将新生期大鼠与哺乳期母鼠分开3h。第22日龄断奶，完成母婴分离后，各组大鼠均给予正常饲料、饮水，喂养至第49日龄。第50～60日龄时，每日上午9:00～11:00给予束缚应激刺激2h，束缚前上肢、前肩及下肢，避免搔抓头面部，可允许少量前后活动。建模成功标准：建模后出现食欲减退、精神不佳、嗜睡、体质量减轻、腹泻等表现，并参考文献[8]的方法计算腹泻指数（稀便率×稀便级），腹泻指数高于建模前，差异有统计学意义（P＜0.05），即为建模成功。50只大鼠中建模成功46只，成功率为92.00%，将建模成功大鼠随机分为B、C、D、E组，各组分别有11、11、12、12只大鼠。A组大鼠以上述方法喂养至第49日龄，此后不予束缚应激刺激，继续以常规饲料、饮水喂养至第60日龄，10只大鼠均纳入研究。

1.4 动物干预干预前取100g防风根，粉碎成细粉，加8倍体积蒸馏水，回流提取，重复3次，每次30 min。3次提取液合并，取1/2提取液浓缩，70℃烘干、粉碎，获得提取物备用。大鼠建模成功后24h开始给药，按照《药理实验方法学》[9]中的换算公式，将各组药物换算成大鼠等效剂量，具体换算公式为：大鼠给药剂量（mg·kg-1）=成人临床剂量（mg·kg-1）×70kg×0.018/0.2kg。 A组、B组灌胃5 mL蒸馏水；C组灌胃5-HT信号抑制剂昂丹司琼2.6mg/（kg·d）（溶于5 mL蒸馏水）；D组分别灌胃昂丹司琼2.6mg/（kg·d）（溶于2.5 mL蒸馏水）+防风提取物6.3mg/（kg·d）（溶于2.5 mL蒸馏水）；E组灌胃防风提取物6.3mg/（kg·d）（溶于5 mL蒸馏水），所有大鼠均给药1次/d，连续14d。

1.5 方法

1.5.1 精神心理行为评估治疗结束后3d进行旷场实验[10]，观察各组大鼠精神心理行为变化。大鼠在实验环境内适应10min后，打开自主行为装置，将大鼠置于敞箱中间，观察并记录大鼠入箱5min内的水平运动次数、垂直运动次数（两前肢同时离地竖起为1次）。其中水平运动次数可评估大鼠兴奋程度，垂直运动次数可评估大鼠对周围环境不确定性及危险性的好奇程度。

1.5.2 排便粪点数、直肠内玻璃小球排出时间检测完成精神心理行为评估后，大鼠禁食24h，以2%戊巴比妥钠50mg·kg-1腹腔注射麻醉，沿大鼠肛门，在距肛门3cm的直肠内放入一枚3mm玻璃小球。大鼠苏醒后，立即将其转移至笼内，常规喂食、饮水，以清洁滤纸铺垫在笼中。束缚2h后记录各组大鼠束缚期间排便粪点数及直肠内玻璃小球排出时间。

1.5.3 结肠黏膜的取材及处理完成以上检测后，将大鼠腹腔注射麻醉，断头处死，取距离肛门3～5cm处远端结肠组织，分为4份，一部分置于4%多聚甲醛固定，以备HE染色，一部分置于10%中性甲醛固定，余下两部分液氮保存。

1.5.4 结肠黏膜组织病理学变化观察取4%多聚甲醛固定的结肠组织，0.9%氯化钠注射液冲洗，磷酸缓冲液浸泡10～12h，脱水，石蜡包埋，4μm切片，烤干后二甲苯透明，脱蜡，水洗，先后行苏木精和伊红染色，光镜下观察大鼠结肠黏膜组织病理学变化。

1.5.5 结肠黏膜肥大细胞数、阳性面积检测取10%中性甲醛固定的结肠组织，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm切片，脱蜡后1%甲苯胺蓝染色1min，加1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。各组随机选6张切片，各切片取3个视野，计数每个视野下的肥大细胞数，计算3个视野的平均值。随机选取3个视野，以MIQAS型医学图像定量分析系统计算肥大细胞阳性面积。肥大细胞胞质或胞膜出现棕褐色颗粒即为染色阳性。

1.5.6 结肠组织5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相对表达量检测采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）法检测。取液氮保存的结肠组织，Trizol法提取总RNA含量，以紫外分光光度计检测纯度、浓度，逆转录成cDNA。进行PCR反应，应用GeneBank基因库内大鼠 5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA基因序列，引物设计及合成在生工生物工程（上海）股份有限公司完成，引物序列见表1。反应条件：95℃ 10min，预变性；95℃ 15s，变性；57℃ 60s，共40个循环。反应完成后，电脑自动绘制各目标基因熔解、扩增曲线，获得阈值循环数。以β-actin为内参，以2-△△CT法计算5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.7 结肠组织5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相对表达量检测采用Western blot法检测。取液氮保存的结肠组织，磷酸缓冲液清洗2次，冰上裂解30min，4℃下12 000r/min离心10min，离心半径8cm，取上清液。以BCA蛋白试剂盒进行蛋白定量，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂奶粉封闭1h。加入兔抗大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1一抗（稀释比例：1∶1 000），4℃摇床孵育过夜。含吐温的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（Tris buffer solution Tween，TBST）洗膜后加入二抗（稀释比例：1∶2 500），室温孵育2h。TBST洗膜后加入电化学发光检测试剂，成像仪曝光成像。以目的蛋白条带与内参β-actin条带灰度值的比值计算目的蛋白相对表达量。

1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用最小显著差异法（least significance difference，LSD）-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠精神心理行为比较各组间总体比较，水平运动次数、垂直运动次数差异有统计学意义（P＜0.001）。与A组比较，B、C、D、E组水平运动次数、垂直运动次数减少（P＜0.05）；与B组比较，C组水平运动次数、垂直运动次数减少，D、E组水平运动次数、垂直运动次数增加（P＜0.05）；与C组比较，D、E组水平运动次数、垂直运动次数增加（P＜0.05）；与D组比较，E组水平运动次数、垂直运动次数增加（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠水平运动次数、垂直运动次数比较（±s，次）Tab.2 Comparison of the number of horizontal and vertical movements in each group（±s， times）

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05；与C组比较，ΔP＜0.05；与D组比较，▲P＜0.05Note:Compared with group A， *P＜0.05;compared with group B， #P＜0.05;compared with group C， ΔP＜0.05;compared with group D，▲P＜0.05

组别 n 水平运动次数垂直运动次数A 组 10 1 605.52±104.15 160.52±21.52 B 组 11 1 215.55±118.52* 70.05±10.52*C 组 11 1 025.35±102.81*# 58.75±10.55*#D 组 12 1 375.54±105.51*#Δ 88.95±11.24*#Δ E 组 12 1 516.52±107.85*#Δ▲ 125.42±13.42*#Δ▲35.731 97.246＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.2 各组大鼠排便粪点数及直肠内玻璃小球排出时间比较各组间总体比较，粪点数、直肠内玻璃小球排出时间差异有统计学意义（P＜0.001）。与A组比较，B、C、D、E组粪点数增多，直肠内玻璃小球排出时间减少（P＜0.05）；与B组比较，C组粪点数增多，直肠内玻璃小球排出时间减少，D、E组粪点数减少，直肠内玻璃小球排出时间增加（P＜0.05）；与C组比较，D、E组粪点数减少，直肠内玻璃小球排出时间增加（P＜0.05）；与D组比较，E组粪点数减少，直肠内玻璃小球排出时间增加（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠粪点数及直肠内玻璃小球排出时间比较（±s）Tab.3 Comparison of fecal count and excretion time of vitreous bulb in rectum among groups（±s）

组别 n 粪点数（个）直肠内玻璃小球排出时间（min）A 组 10 2.99±0.42 22.58±3.21 B 组 11 5.01±0.73* 16.98±1.75*C 组 11 5.72±0.82*# 15.21±1.35*#D 组 12 4.12±0.75*#Δ 18.02±1.22*#Δ E 组 12 3.43±0.61*#Δ▲ 19.85±2.12*#Δ▲28.924 20.627＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.3 各组大鼠结肠黏膜组织病理学变化比较 HE染色显示，A组结肠黏膜形态无异常，上皮完整连续，腺体规则排列，结构较清晰，细胞形态正常。B、C组结肠黏膜上皮与腺体破坏，间质内未见炎性细胞、红细胞。与B、C组比较，D、E组结肠黏膜上皮较完整，腺体排列较整齐，间质未见炎性细胞、红细胞，其中E组改善更显著。见图1。

图1 各组大鼠结肠黏膜组织病理学变化（HE染色，400×）Fig.1 Histopathological changes of colonic mucosa in each group(HE staining， 400×)

2.4 各组大鼠结肠黏膜肥大细胞数、阳性面积比较各组间总体比较，肥大细胞数、阳性面积差异有统计学意义（P＜0.001）。与A组比较，B、C、D、E组肥大细胞数、阳性面积增高（P＜0.05）；与B组比较，C组肥大细胞数、阳性面积增高，D、E组降低（P＜0.05）；与C组比较，D、E组肥大细胞数、阳性面积降低（P＜0.05）；与D组比较，E组肥大细胞数、阳性面积降低（P＜0.05）。见表4、图2。

图2 各组大鼠结肠黏膜肥大细胞数变化（甲苯胺蓝染色，200×）Fig.2 Changes of mast cells in colonic mucosa in each group（toluidine blue staining， 200×）

表4 各组大鼠结肠黏膜肥大细胞数、阳性面积比较（±s）Tab.4 Comparison of mast cell number and positive area in colonic mucosa in each group（±s）

组别 n 肥大细胞数（个/HP）肥大细胞阳性面积（μm2）A 组 10 3.58±0.32 53.08±3.54 B 组 11 6.05±0.66* 70.01±4.45*C 组 11 6.58±0.71*# 74.15±5.01*#D 组 12 4.35±0.45*#Δ 68.47±4.88*#Δ E 组 12 4.05±0.35*#Δ▲ 61.25±4.04*#Δ▲68.209 36.999＜0.001 ＜0.001 F值P值

2.5 各组大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA表达比较各组间总体比较，5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相对表达量差异有统计学意义（P＜0.001）。与A组比较，B、C、D、E组5-HT3R、TPH1 mRNA相对表达量升高，5-HT4R mRNA相对表达量降低（P＜0.05）；与B组比较，C组5-HT3R、TPH1 mRNA相对表达量升高，5-HT4R mRNA相对表达量降低，D、E组5-HT3R、TPH1 mRNA相对表达量降低，5-HT4R mRNA相对表达量升高（P＜0.05）；与C组比较，D、E组5-HT3R、TPH1 mRNA相对表达量降低，5-HT4R mRNA相对表达量升高（P＜0.05）；与D组比较，E组5-HT3R、TPH1 mRNA相对表达量降低，5-HT4R mRNA相对表达量升高（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1 mRNA相对表达量比较（±s）Tab.5 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 mRNA in each group（±s）

组别 n A组 10 B组 11 C组 11 D组 12 E组 12 F值P值5-HT3R 5-HT4R TPH1 0.47±0.21 1.39±0.23 0.82±0.25 1.61±0.28* 0.85±0.15* 1.71±0.25*1.82±0.23*# 0.62±0.13*# 1.92±0.21*#1.32±0.22*#Δ 1.05±0.22*#Δ 1.54±0.18*#Δ 0.92±0.25*#Δ▲ 1.25±0.22*#Δ▲ 1.24±0.14*#Δ▲54.139 26.932 45.005＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.6 各组大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白表达比较各组间总体比较，结肠组织5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相对表达量差异有统计学意义（P＜0.001）。与A组比较，B、C、D、E组5-HT3R、TPH1蛋白相对表达量升高，5-HT4R蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与B组比较，C组5-HT3RT、TPH1蛋白相对表达量升高，5-HT4R蛋白相对表达量降低，D、E组5-HT3RT、TPH1蛋白相对表达量降低，5-HT4R蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与C组比较，D、E组5-HT3R、TPH1蛋白相对表达量降低，5-HT4R蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与D组比较，E组5-HT3R、TPH1蛋白相对表达量降低，5-HT4R蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。见图3、表6。

表6 各组大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白相对表达量比较（±s）Tab.6 Comparison of relative expression of 5-HT3R， 5-HT4R and TPH1 protein in each group（±s）

组别 n A组 10 B组 11 C组 11 D组 12 E组 12 F值P值5-HT3R 5-HT4R TPH1 0.22±0.03 0.85±0.08 0.21±0.03 0.61±0.09* 0.18±0.05* 0.51±0.06*0.82±0.08*# 0.14±0.02*# 0.75±0.08*#0.48±0.06*#Δ 0.39±0.05*#Δ 0.42±0.04*#Δ 0.31±0.04*#Δ▲ 0.57±0.05*#Δ▲ 0.28±0.03*#Δ▲150.071 326.475 183.408＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

图3 各组大鼠5-HT3R、5-HT4R、TPH1蛋白表达比较Fig.3 Comparison of 5-HT3R，5-HT4R and TPH1 protein expression in each group

3 讨论

腹泻型肠易激综合征是多种因素综合作用的结果，其中肥大细胞异常具有重要作用[11]。胃肠道内肥大细胞活化可引发肠道黏膜上皮、神经肌肉功能紊乱，增加内脏敏感性，导致胃肠道运动模式改变[12]。另外，肥大细胞不仅可将外界刺激产生的免疫反应信息向神经系统传递，还可接受神经系统调控，将刺激信息反馈给靶器官，诱导产生免疫应答反应，故其可能是腹泻型肠易激综合征发病机制中一个重要调节点[13]。因此，采取积极措施减少结肠黏膜肥大细胞数量，成为控制腹泻型肠易激综合征病情、改善患者预后的治疗方向。西医治疗腹泻型肠易激综合征多以对症处理为主，如止泻、止痛、抗焦虑等，但部分患者整体疗效仍然欠佳[14]。

中药防风为伞形科植物防风的干燥根，具有清热解毒、胜湿止痛、解表祛风等功效，其化学成分包括多糖、挥发油、有机酸、色原酮等，具有清除自由基、抗氧化、抗炎、抗菌、镇痛、解热、免疫调节等功效[15-16]，但目前关于防风提取物对腹泻型肠易激综合征的疗效及其机制尚无定论。临床上所使用的防风提取物多为水提取物或水提醇沉提取物，研究发现，相较于防风水提醇沉提取物，防风水提取物毒性更小，更符合用药合理性，符合临床上利用药物“偏性”合理安全发挥疗效的要求[17]，因此本研究将防风水提取物应用于动物实验。结果发现，防风提取物可减轻腹泻型肠易激综合征大鼠精神心理行为异常变化，减少排便粪点数，改善直肠内玻璃小球排出时间，有效改善结肠黏膜形态结构等，还可减少结肠黏膜肥大细胞数和阳性面积，提示防风提取物对腹泻型肠易激综合征大鼠病情缓解有益，可减少结肠黏膜肥大细胞数，疗效显著。郭军雄等[18]发现在“痛泻要方”基础上配伍防风，能够减轻溃疡性结肠炎大鼠外周血炎症因子水平，改善肠蠕动，减轻结肠黏膜病变，与本研究结果一致。屈映等[19]也证实防风可减轻溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜损伤指数及结肠病理改变评分，促进肠黏膜修复。

5-HT是一种吲哚芳香族化合物，人体内95%左右存在于胃肠道，与消化道运动、分泌、吸收等密切相关[20]。胃肠道受到各种刺激时，可激活肥大细胞，促使其脱颗粒并释放5-HT，作用于临近的神经纤维，引发感觉神经纤维兴奋，进行信号传递。5-HT主要是与特异性受体，特别是5-HT3R、5-HT4R结合，从而发挥生理作用。5-HT3R在肠道内多表达于黏膜层细胞、黏膜下层细胞及肌间神经丛上神经细胞，可参与肠道蠕动、分泌、内脏感觉等自主神经功能[21]。5-HT4R多表达于肠黏膜下层细胞，参与胃肠道运动及分泌，且可调节胃肠道蠕动反射，影响肠道感觉功能[22]。赵鲁卿等[23]发现，中药方治疗腹泻型肠易激综合征大鼠能够获得理想疗效，其作用机制可能与降低5-HT3R和提高5-HT4R表达有关。另外，研究发现5-HT信号通路中，TPH1能直接对5-HT生物合成产生影响，参与肠道局部5-HT水平的调节[24]。以上研究均提示，5-HT信号轴可能在腹泻型肠易激综合征发病中具有重要作用。昂丹司琼是一种高选择性5-HT信号抑制剂，可参与及调控机体炎性反应、氧化反应等过程，临床多用于预防放化疗所致恶心、呕吐及术后急性呕吐，本研究采用昂丹司琼作为5-HT抑制剂，观察防风提取物对5-HT轴的影响。本研究发现，防风提取物可提升结肠组织中5-HT3R、TPH1 mRNA及蛋白表达量，降低5-HT4R mRNA及蛋白表达量，并通过5-HT抑制剂昂丹司琼验证了这一结果，故推测防风提取物改善腹泻型肠易激综合征大鼠症状的作用机制，可能与调节结肠黏膜肥大细胞的5-HT信号轴有关。

综上所述，防风提取物可减少腹泻型肠易激综合征大鼠结肠黏膜肥大细胞，其作用机制可能与调节5-HT信号轴有关。本研究仍有不足之处，如实验动物样本量较少，观察周期短等，而且防风提取物对结肠黏膜肥大细胞的影响是否还有其他途径参与，仍有待进一步研究。