同一生境下白及与黄花白及内生菌群差异的初步研究

涂然 武坤毅 冯正平 王静 卢芳芳 崔浪军

摘 要： 为揭示白及与黄花白及内生菌群落特征异同的内在机制，该文运用末端限制性酶切片段长度多态性分析技术对白及和黄花白及叶、茎、块茎、根等组织中内生细菌16S rDNA、内生真菌ITS区进行检测，分析内生菌丰度及多样性指数，运用主成分分析、聚類分析和相关性分析对比白及与黄花白及内生菌差异。结果表明：（1）白及和黄花白及各组织内生细菌H指数为1.77～2.51，内生真菌H指数为1.79～3.18。（2）内生细菌表现为茎、块茎和根中相似，叶中差异较大;内生真菌则表现出明显的特异性。（3）白及药用部位多糖含量与内生细菌中的7个T-RFs、内生真菌中的2个T-RFs呈相关性，黄花白及药用部位多糖含量与内生细菌中的3个T-RFs、内生真菌中的6个T-RFs呈相关性。综上结果表明，同一生境下，白及和黄花白及内生细菌除叶组织外，其他组织相似，内生真菌则差异显著，部分内生菌和药用部位多糖含量存在相关性。

关键词： 内生菌， 白及， 黄花白及， T-RFLP， 白及多糖

中图分类号： Q948  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1173-08

Abstract： In order to reveal similarities and differences in the feature of endophytic community， endophytic flora of Bletilla striata and B. ochracea were compared in the same habitat. Endophytic bacteria 16S rDNA and endophytic fungi ITS from tissues（stem， leaf， tuber and root） of B. striata and B. ochracea were studied by terminal restriction fragment length polymorphism method. Abundance and biodiversity index were analyzed. Differences of endophyte between B. striata and B. ochracea were compared by principal component analysis， cluster analysis and correlation analysis. The resutls were as follows： （1） Shannon-Wiener indexes of endophytic bacteria and endophytic fungi in each tissue sample from B. striata and B. ochracea were between 1.77 to 2.51 and 1.79 to 3.18， respectively. （2） The endophytic bacteria of B. striata and B. ochracea were similar in stem， tuber and root， but quite different in leaf. The significant specificity was shown in endophytic fungi on the opposite. （3） Polysaccharides content in medicinal parts of B. striata was correlated with seven and two T-RFs in endophytic bacteria and endophytic fungi， respectively. Meanwhile， polysaccharides content in medicinal parts of B.ochracea was correlated with three and six T-RFs in endophytic bacteria and endophytic fungi， respectively. In summary， the endophytic bacteria of B. striata and B. ochracea from the same habitat in each part of tissues was similar except the leaf. However， endophytic fungi were significantly different. Some endophyte associated with polysaccharide content of the medicinal part.

Key words： endophytic， Bletilla striata， B. ochracea， T-RFLP， polysaccharide

白及属（Bletilla）是温带地生兰科（Orchidaceae）多年生草本植物。我国有白及属植物4种，分别是白及（Bletilla striata）、华北白及（B. sinensis）、小白及（B. formosana）和黄花白及（B. ochracea）（中国植物志编委会，1999）。其中，白及是我国传统中药材，药用已有上千年历史，广泛用于治疗咳血吐血、外伤出血、皮肤破裂、肺结核咳血和溃疡病出血等（国家药典委员会，2000）。白及以块茎入药，含粘胶质、菲衍生物、蒽醌衍生物等成分，其中粘胶质富含的白及多糖是其主要药效成分（韩广轩等，2001）。虽然黄花白及花黄色或淡黄色，与白及的紫色花差别大，但其块茎（假鳞茎）性状及大小与白及相似，外皮纵皱，棕黄色或黄色，较难与白及区分（仇硕等，2017）。加之，二者特征指纹图谱难以区分（陈美君等，2017），有时黄花白及的多糖含量高于白及（朱新焰等，2018）。因此，有黄花白及收入药典作为白及药材的另一来源的说法，同时市场上已经有大量的黄花白及作为白及的替代品在销售（陈美君等，2017;仇硕等，2017）。因此，二者相似性与差异性的研究对于白及与黄花白及的开发利用具有重要的指导意义。

内生菌是指生长于植物活体组织内部，但不引起明显负面影响的细菌或真菌（Wilson，1995）。近年来，植物内生菌作为生物活性物质筛选的重要来源已成为研究的热点（Alvin et al.，2014）。内生菌与宿主长期共生的过程中，由于基因转移，内生菌可能与宿主具有合成次級代谢产物的相似途径，可以生成与宿主相同的部分活性物质，甚至于植物的某些活性物质的合成与内生菌密切相关（Wang & Dai，2011）。已有的研究表明，内生菌对兰科植物具有重要的生物学功能，在种子萌发、植株生长、增强抗逆性及生防等方面都有促进作用（Tsavkelova et al.，2007;程萍等，2008;俞婕等，2010;Stckel et al.，2014）。白及假鳞茎块根部分内生细菌的组成及优势菌群主要是鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属（陈泽斌等，2016），而黄花白及的内生细菌的组成与优势菌群还未见相关报道。植物内生菌的群落结构组成不仅与植物本身的遗传特性相关，还与植物生长年限、生境气候条件、土壤特性等密切相关（Andreote et al.，2014;Wagner et al.，2016）。因此，在尽可能一致的条件下对比白及与黄花白及内生菌的群落结构对阐明二者的差异与相似特征具有重要的指导意义。

基于此，本研究以陕西省安康市旬阳县境内同一生境下、相同生长年限、相同田间管理模式下的白及（B.striata） 和黄花白及（B.ochracea）为材料，运用末端限制性酶切片段长度多态性分析（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）对两种白及的不同组织部位内生细菌和内生真菌的群落结构进行对比，分析白及和黄花白及内生菌差异状况，并进一步探讨内生菌与多糖含量的相关性，以期为研究两种白及内生菌群落特征的异同提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 采样和表面消毒

采样地点位于陕西省安康市旬阳县境内（109°20′46″E、32°58′13″N），海拔1 783 m。2012年7月，采集同一生境下两年生人工培育白及和黄花白及作为研究材料。 该采样点地处陕西省秦岭山区东段，汉江横贯其中，位于北亚热带温暖区域，属湿润山地气候。年均降雨量为851 mm，年平均气温为15.4 ℃，地貌以山为主。白及和黄花白及处于开花期，根据不同花色区分白及和黄花白及。随机选取5个采样点，保留根部土壤并用湿布覆盖，整株植物保存于低温下，立即带回实验室做表面消毒处理。首先，叶、茎、块茎、根自来水冲洗3次去除黏附土壤，70%乙醇浸泡1 min;然后，新鲜配置的次氯酸钠溶液清洗4 min（块茎和根）、3 min（叶和茎），70%乙醇漂洗3次各30 s;最后，用无菌去离子水冲洗3次，无菌滤纸擦干。随机选取白及和黄花白及各5株，按叶、茎、块茎和根不同组织剪成小段，液氮速冻后，-80 ℃保存用于DNA提取。其余白及和黄花白及样本，自然风干后，粉碎过筛，-20 ℃保存用于有效成分测定。

1.2 多糖提取和含量测定

取黄花白及和白及块茎部位，参考徐花荣（2006）的方法，采用碱水提醇沉法提取多糖。采用苯酚硫酸法（100 μL多糖溶液+120 μL 6%苯酚溶液+650 μL浓硫酸混合），490 nm处测定吸光度值，与葡萄糖标准曲线对照，计算多糖含量。

1.3 宏基因组提取及PCR扩增

取白及与黄花白及各组织（叶和茎0.5 g;块茎和根1.0 g）进行液氮研磨。用CTAB （cetyltrimethy-lammonium bromide）法提取总DNA。得到的DNA用200 μL TE缓冲液（10 mmol·L-1 Tris-HCl，1 mmol·L-1 EDTA，pH 8.0）溶解。

真菌ITS区扩增：ITS1F 3′-AATGAAGGAGATTTACTGGTTC-5′ （FAM）， ITS4R 3′-CGTATAGTTATTCGCCTCCT-5′。PCR反应体系25 μL，含4 μL （100 ng ）模板DNA，首尾引物各1 μL （20 μmol·L-1），PCR mix（TaKaRa） 12.5 μL，加去离子水补足到25 μL。扩增程序如下：95 ℃ 5 min 1个循环;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，25个循环;72 ℃ 5 min 1个循环。块茎组织比较特殊，采取的扩增程序如下：95 ℃ 5 min 1个循环;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，32个循环，72 ℃ 5 min 1个循环。

细菌16S rDNA 扩增：63F 3′-CTGAACGTACACAATCCGGA-5′， 1494R 3′- CAGCATTGTTCCATYGGCAT-5′ （HEA）， PCR反应体系25 μL，含4 μL （100 ng ）模板DNA，首尾引物各1 μL （20 μmol·L-1），PCR mix（TaKaRa） 12.5 μL，加去离子水补足到25 μL。扩增程序如下：95 ℃ 5 min 1个循环;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，30个循环;72 ℃ 5 min 1个循环。块茎组织比较特殊，采取的扩增程序如下：95 ℃ 5 min 1个循环，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环;72 ℃ 5 min 1个循环。每个样本重复3次，PCR产物混匀，10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色后紫外光下参考DL2000 DNA ladder（TaKaRa）切下目标条带，回收纯化。

1.4 酶切

PCR扩增产物用限制性内切酶Msp I 或Hae Ⅲ （TaKaRa）在37 ℃水育下消解4 h，设置3个重复。75 ℃ 10 min灭活处理后，混匀3个平行样本，1.5 g·L-1琼脂糖凝胶电泳分离，其余步骤同上。参照50 bp的DNA ladder确定酶切片段的碱基长度，小于30 bp的片段不回收。分离纯化标记的片段，在GeneScan模式下，使用ABI Prism 310毛细管测序仪（Shanghai GeneCore BioTechnologies Co.，Ltd .）检测。随后，用软件GeneMapper 3.7对荧光图进行分析，确定终端限制片段（T-RFs）的峰值大小、面积和高度。合格酶切片段的大小为30～500 bp，荧光强度在100个单位以上，峰面积超过总体峰面积的0.5%（在0.5%以下认为是背景噪音）。Species richness是用同一个文件中总的T-RFs数来计算（大小为30～500 bp，不同大小的T-RFs）。

The Shannon-Wiener biodiversity index（H）=-∑pi×lnpi。

式中：pi指群落中第i物种个体峰高与所有峰值高度之和的比例。

The Shannon eveness index（E）=H/Hmax。

式中：Hmax=lnS;S是每个样本中T-RFs的数量。

1.5 统计分析

所有统计分析都是使用软件SPSS 18.0完成。对于T-RFLP分析，将T-RFs归一化峰值用于主成分分析（PCA）和聚类分析。MiCA PAT +在线分析工具用于比对每个T-RFs代表的占主导地位的细菌或真菌。

2 结果与分析

2.1 酶切产生的T-RFs 数量

用GeneMapper3.7软件分析Msp I 或Hae Ⅲ酶切产生的荧光图谱，得到白及与黄花白及共8个组织样本的T-RFs数量，各组织样本中T-RFs的均值介于5～37之间（表1）。就内生细菌而言，白及和黄花白及都是叶组织产生的T-RFs最多，但各组织间差异不大（P>0.05）。就整株而言，黄花白及产生的T-RFs数量略多于白及。而就内生真菌而言，Msp I酶切产生的T-RFs，在白及和黄花白及根组织中显著高于其他组织（P<0.05），而两者之间无显著差异（P>0.05）。Hae Ⅲ酶切产生的T-RFs，白及根组织中显著高于其他组织（P<0.05），而黄花白及根組织与其他组织之间无显著差异（P>0.05）。对比Msp I和Hae Ⅲ酶切结果，白及和黄花白及各组织内生细菌和内生真菌都是Msp I较Hae Ⅲ多。因此，从多样性检测的结果来看，Msp I较Hae Ⅲ好，所以我们选择Msp I的T-RFLP数据来进行MiCA PAT+在线比对分析。

2.2 生物多样性指数分析

为了更加清楚地反映黄花白及和白及各组织内生菌群结构，我们基于T-RFLP数据统计分析了各组织内生菌的H、E指数 （表2）。白及和黄花白及各组织内生细菌H指数介于1.77～2.51之间，其中，叶组织的H指数较其他组织高，但差异不显著（P>0.05）。各组织的E指数相差不大。两种白及内生真菌H指数在1.79～3.18之间，根组织的H指数较其他组织高，但白及和黄花白及根组织之间无显著差异。白及和黄花白及各组织之间细菌分布相对均匀，而真菌则在块茎组织中的分布相对集中。整体来看，白及和黄花白及各组织内生细菌、内生真菌多样性的状况相一致，都表现为内生细菌多样性从地下部分向地上部分增加;内生真菌从地上部分向地下部分增加。

2.3 白及和黄花白及内生菌的主成分分析和聚类分析

基于白及和黄花白及各组织部位内生细菌、内生真菌的T-RFs峰面积，进行主成分分析（principal component analysis，PCA）和聚类分析。内生细菌部分PCA结果显示，8个组织聚成三类。第一类由黄花白及茎、块茎、根和白及茎、块茎、根组成;第二类由黄花白及叶单独组成;第三类由白及叶单独组成（图1：a）。聚类分析结果表明，黄花白及块茎和白及块茎先聚为一支，然后和黄花白及根聚为一支，白及根和白及茎聚为一支（图1：b）。这表明黄花白及和白及块茎、根等组织内生细菌菌群更为相似。黄花白及叶和白及叶没有聚为一支，表明黄花白及和白及叶内生细菌菌群差异较大，且与其组织也有较大差异。内生真菌部分PCA结果显示8个组织聚成四类，第一类由白及叶、茎、块茎组成;第二类由黄花白及叶、茎、块茎组成;第三类由白及根单独组成;第四类由黄花白及根单独组成（图1：c）。聚类分析表明，黄花白及叶、茎和块茎聚为一支，白及叶、茎和块茎聚为一支，接着两组重新聚为一支。黄花白及根和白及根则没有聚为一支（图1：d），与PCA结果相符合。黄花白及和白及的内生真菌表现出明显的特异性。

2.4 内生菌与多糖含量的相关性分析

对黄花白及和白及药用部位块茎多糖含量进行检测，结果见表3。每克黄花白及块茎中所含的纯多糖为6.50 mg，每克白及块茎中所含的纯多糖为7.75 mg，两种白及块茎的多糖含量有统计学差异（P<0.05）。

黄花白及和白及的内生细菌和内生真菌与多糖含量的相关性分析结果显示，黄花白及块茎内生细菌中有3个T-RFs与多糖含量呈显著相关;白及叶、茎和块茎内生细菌中有3个、3个和1个T-RFs与多糖含量呈显著或极显著相关。黄花白及叶和根内生真菌中有1个和5个T-RFs与多糖含量呈显著相关;白及茎和块茎内生真菌中各有1个T-RF与多糖含量呈显著或极显著相关（表 4）。

对表4中的T-RFs进行MiCA PAT+在线比对， 结果见表5。白及茎中的短波单胞菌属（Brevundimonas）、块茎中的窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）、黄花白及块茎中的盐单胞菌属（Halomonas）可能与多糖含量存在相关性。

3 讨论与结论

野生白及资源的枯竭与日益递增市场需求之间的突出矛盾迫使黄花白及资源开发和白及人工保育迫在眉睫。本研究中白及和黄花白及在同一环境下生长，都处于花期，检测叶、茎、块茎和根四种不同组织部位内生菌，土壤环境也基本一致。结果显示白及和黄花白及内生细菌除叶中差异较大外，整体较为相似，且多样性呈现出从地上部分向地下部分降低趋势。内生真菌整体差异较大，尤其是根，多样性表现出从地下部分向地上部分降低趋势。首先，叶组织上的气孔作为空气中细菌进入植物内的门户，可能是导致白及和黄花白及内生细菌多样性呈现从地上部分向地下部分降低趋势的主要原因;根尖部位分生组织的裂隙可能是导致白及和黄花白及内生真菌多样性呈现从地下部分向地上部分降低的趋势的主要原因（Mccully，2001;Srensen & Sessitsch，2007）。其次，植物会倾向选择有利于自身生态位和进化的微生物共生（Compant et al.，2005;Srensen & Sessitsch，2007）。外源微生物无论从根尖或叶气孔进入植物内部，由于宿主内环境差异（pH、离子浓度等）和分泌抗菌物质类别的不同（萜类化合物，苯并恶嗪酮，特别是类黄酮和异黄酮类）（Bais et al.，2006），宿主植物对大多数的外源微生物加以清除，但适合自身的竞争性内生菌保留（Thrall et al.，2007），并迅速在细胞间隙大量繁殖（Dong et al.，2003;Zakria et al.，2007）。这可能是造成白及和黄花白及叶内生细菌、根内生真菌差异较大的原因。现有研究显示，白及和黄花白及根部的内生真菌虽然都属于担子菌门和子囊菌门，但白及根部内生真菌主要为梨形孢属，而黄花白及根部有顶孢霉属、柱孢属、镰刀菌属、轮枝孢属、瘤菌根菌属、Rhexocercosporidium 属和腊壳菌属真菌，真菌类群组成存在巨大差异（刘准等，2013;席刚俊等，2017）。植物-假单胞菌的关联实验发现，生长于相同生境下，两种不同植物亚麻和番茄只选择了所涉及的假单胞菌属的特定少量“菌株”作为二者共有内生菌，而不是整个假单胞菌群落的菌作为共有菌（Lemanceau et al.，1995）。关于白及和黄花白及对内生菌选择倾向差异的相关机制，还需进一步研究。

根据与多糖含量存在相关性的T-RFs不同，仅能推测与白及和黄花白及药用部位多糖含量积累相关的内生菌存在差异。原因在于以下两个方面。第一，T-RFLP技术产生的T-RFs所代表的是一种或者一类菌的集合，若对内生菌种属进行进一步的鉴定还需要通过克隆实验或者高通量宏基因组测序，以获取内生细菌的16S rRNA、内生真菌的ITS序列信息（Siqueira et al.，2017）。第二，由于MiCA PAT+在线分析工具的局限性，细菌部分仅能比对到T-RFs片段可能对应的细菌种属信息，真菌部分的数据库不完善，无法比对到T-RFs片段对应的真菌种属信息。因此，从比对到的结果来看，与白及多糖含量存在相关性的内生细菌可能是短波单胞菌属（Brevundimonas）、窄食单胞菌属（Stenotrophomonas）等，与黄花白及多糖含量存在相关性的内生细菌可能是盐单胞菌属（Halomonas）。

白及和黄花白及虽同为兰科白及属植物，但内生菌存在差异，尤其是内生真菌部分。因此，在对白及和黄花白及保育策略制定、资源合理开发上区别对待可能更为合理。

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（责任编辑 何永艳）