黑果腺肋花楸黄酮提取物修复小鼠急性酒精肝损伤的研究

郝思奥，李艳，2*，贺艳楠，吴楠

（1.河北科技大学食品与生物学院，河北 石家庄 050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北 石家庄 050018）

黑果腺肋花楸是一种新型的药食兼用浆果，其营养丰富，富含膳食纤维、蛋白质、糖类和多酚等营养物质[1]。黑果腺肋花楸中的酚类物质，尤其是黄酮类物质含量丰富，这些黄酮类化合物已经被证实具有良好抗氧化性[2-3]、抑菌消炎性[4-5]、抗癌、抗肿瘤[6-7]、降血压、降血糖[8-9]、预防和治疗消化系统疾病[10]及保护心血管[11]等多种药用功效。目前，我国对于黑果腺肋花楸资源的开发主要集中于种植技术的优化[12-13]、果实成分的提取[14-15]、黑果腺肋花楸食品或饮料的加工[16-17]等方面。在黑果腺肋花楸活性物质生理功能方面，主要集中在抗氧化性研究[2-3]和抗菌性[4]研究，其它功能相关研究较少且欠深入。

随着人们生活水平的提高与现代社交的发展，酒精肝损伤已成为影响人们日常生活的常发疾病[18]。研究证实黄酮类化合物对酒精肝损伤有保护或治疗作用[18-20]。雷斯瑀等[18]研究发现赶黄草总黄酮提取物对小鼠酒精性肝损伤有较好的治疗作用；陈发菊等[19]研究证实藤茶总黄酮对酒精性肝损伤小鼠具有一定保护作用，可能与增加肝组织抗氧化酶的活性、降低脂质过氧化水平、降低肝组织IL-4、IL-6、TNF-α等炎症因子水平有关；李志超等[20]研究证实矮地茶黄酮通过降低肝组织的损伤和炎症程度、减少脂质过氧化，提高机体抗氧化能力，防止氧化应激的发生，改善酒精对大鼠造成的脂质代谢紊乱来发挥护肝作用。黑果腺肋花楸黄酮是否对酒精肝损伤有保护及修复作用，目前国内尚无相关研究。本研究以黑果腺肋花楸为原料，提取黄酮类化合物，通过建立急性酒精肝损伤小鼠模型，研究黑果腺肋花楸黄酮提取物对急性酒精肝损伤的修复能力，为黑果腺肋花楸功能产品的开发奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物与原料

昆明小鼠，体重18 g～22 g，SPF级，雄鼠：河北医科大学实验动物中心。动物质量合格许可证号：SCXK（冀）2013-1-003。小鼠饲养于温度和湿度适宜的清洁级动物房，自由进食与饮水。

黑果腺肋花楸果实：秦皇岛金樽酒业有限公司，产自河北省卢龙县。

1.1.2 试剂及试剂盒

甲醛、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）试剂盒、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

101-0AB电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；ES-188ZL电子显微镜：麦克奥迪实业集团有限公司；EPOCH2酶标仪：美国博腾仪器有限公司；AR1140电子分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器厂；DELTA320 pH数字酸度计：梅普勒-托利多仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵、Re-2O1旋转蒸发器、2O1升降恒温水浴锅：河南省巩义市英峪予华仪器厂；1290-6420超高压液相色谱-质谱联用仪：安捷伦科技（中国）有限公司

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸黄酮类化合物提取

黑果腺肋花楸中黄酮类化合物提取工艺：料液比1∶15（g/mL），乙醇体积分数 50%，共提取 2次，提取温度分别为65℃和75℃、提取时间均为80 min、提取时均超声波处理，超声功率90 W。黑果腺肋花楸醇提液经旋转蒸发器浓缩并回收乙醇，所得剩余液为黄酮提取物浓缩液。

1.3.2 黑果腺肋花楸黄酮提液成分检测

参照陈家鹏[21]方法测定黑果腺肋花楸浓缩醇提液中总黄酮含量，参照于海波[22]、孙冰婷等[23]的方法进一步确定黄酮浓缩液的黄酮类物质成分。

1.3.3 酒精诱导的小鼠急性肝损伤模型建立

将55只体重为18 g～22 g的昆明小鼠（雄鼠）随机分置在5个鼠笼中，进行1周适应性喂养后，称重并按体重均分为正常组、模型组、低剂量组、高剂量组和药物组，药物组所用药物为水飞蓟素。分组后继续喂养（食水不限）28 d，灌胃剂量见表1，连续灌胃，每日1次。第22天开始，按表1对相应组的小鼠灌胃酒精，剂量为12 mL/kg BW，连续灌胃7 d，最后1次灌胃后空腹（禁食不禁水）16 h，称重，并在眼球取血后颈椎脱臼处死，存留小鼠血清及肝脏组织，备用。

表1 小鼠灌胃剂量Table 1 Intragastric doses in mices

1.3.4 检测方法

小鼠血清酶活性测定：谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性、丙二醛（MDA）含量、总抗氧化能力（T-AOC）均用试剂盒按照其提供的方法进行。

肝脏组织酶活性测定：取肝组织称重，加入9倍量生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆后2 500 r/min离心10 min，取上清液按照试剂盒提供方法检测谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性、丙二醛（MDA）含量和总抗氧化能力（T-AOC）。

1.3.5 肝组织病理学观察

处死小鼠后迅速取出肝脏，取肝左叶相同部位一小块组织，用4%甲醛溶液固定，酒精脱水、浸蜡、包埋、切片并用苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法染色，制成病理切片，电子显微镜观察各组小鼠肝细胞形态及肝小叶结构并摄片。

1.4 数据处理

研究数据均采用平均值±标准差表示，用SPSS 23.0统计学软件进行T-检测及单因素方差分析，p<0.05表示具有显著差异，p<0.01表示具有极显著差异。

2 结果与分析

2.1 黑果腺肋花楸黄酮提取液中总黄酮含量及活性成分检测结果

经检测，黑果腺肋花楸黄酮提取浓缩液中总黄酮含量为69.12 mg/mL，超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）检测黄酮物质成分结果见表2。

表2 黄酮提取物（浓缩液）黄酮类物质组成及含量检测结果Table 2 Determination of composition and concentration of flavonoids in concentrated flavonoid extraction

黑果腺肋花楸黄酮提取物中共检测出4种黄酮类化合物，分别是绿原酸、山奈酚、槲皮素和芦丁，其中绿原酸含量最高，约占总黄酮化合物的78%，其次为芦丁。

2.2 黄酮提取液对酒精肝损伤小鼠肝组织中各项指标的影响

酒精经肠胃吸收可直接进入肝脏参与代谢，增强肝组织中超氧阴离子自由基、羟基自由基等的生成[24]，引起脂质的过氧化反应，产生MDA，并抑制肝脏内如GSH-Px等抗氧化剂的生成，使肝组织发生病变，从而引起肝脏中AST及ALT活性的升高[24]，联合检验肝组织中各指标可准确反映肝组织的生理状况，结果见表3。

表3 肝组织AST、ALT、GSH-Px活性及MDA含量和总抗氧化能力Table 3 AST activities，ALT activities，GSH-Px activities，MDA content and total antioxidant capacity in liver tissues

由表3可知，模型组小鼠的丙二醛含量、AST活性（p<0.05）、ALT活性（p<0.01）均高于正常组；GSH-Px活性与总抗氧化能力低于正常组，可见急性酒精肝损伤小鼠模型建立成功。

低剂量组小鼠肝组织AST活性（p<0.05）、ALT活性低于与模型组，表明低剂量黑果腺肋花楸黄酮提取液饲喂对酒精导致肝损伤的小鼠肝组织转氨酶活性上升有显著缓解作用，证实黑果腺肋花楸黄酮提取液有保肝护肝功效。低剂量组GSH-Px指标较正常组与模型组均有显著升高，说明低剂量黄酮提取物不仅可改善酒精肝损伤，也可增强机体抗氧化能力。低剂量组丙二醛含量较正常组与模型组均有下降，总抗氧化能力较正常组与模型组均有提高，实验结果表明，低剂量黄酮提取物饲喂可以增强小鼠体内抗氧化能力，同时对其肝脏有显著的保护作用。

高剂量组AST活性和ALT活性与模型组相比没有下降，表明黑果腺肋花楸黄酮提取物保肝功效的发挥有剂量限值，当浓度过高时，无法起到保肝作用，这一现象也被很多研究所证实[25-28]。高剂量组MDA含量与正常组相比没有下降，T-AOC指标也低于正常组，表明剂量过高时，体内抗氧化能力锐减甚至无法起到作用。

药物组亦无法抑制酒精肝损伤导致的AST、ALT两项指标的升高，GSH-Px活性极显著高于模型组，MDA含量低于模型组，但T-AOC极显著弱于模型组，表明所用药物对小鼠酒精肝损伤修复作用甚微，且无法显著提升小鼠机体的抗氧化能力。

2.3 黄酮提取液对酒精肝损伤小鼠血清中各项指标的影响

肝细胞膜受损或肝细胞发生坏死时，肝中转氨酶会进入血清使血清中酶活增高，检验血清中转氨酶活性，可间接反映肝组织损伤程度。联合检验血清中MDA含量、GSH-Px活性及T-AOC，可进一步反映肝组织受损状况及小鼠机体抗氧化能力。实验所得结果见表4。

表4 血清AST、ALT、GSH-Px活性及MDA含量和总抗氧化能力Table 4 AST activities，ALT activities，GSH-Px activities，MDA content and total antioxidant capacity in serum

由表4可得，模型组小鼠血清中AST、ALT活性高于正常组，即肝损伤导致的细胞坏死或细胞膜破损使肝脏中转氨酶进入血清，使血清中转氨酶活性升高，肝损伤模型建立成功。模型组GSH-Px活性（p<0.05）、T-AOC低于正常组，MDA含量高于正常组，说明酒精导致的肝损伤，也间接影响机体抗氧化能力。

低剂量组小鼠血清AST、ALT活性低于模型组，与肝组织指标所得结论一致，即低剂量（60 mg/kg BW）黑果腺肋花楸黄酮提取液有优良保肝功效。GSH-Px活性和T-AOC较模型组有所提高，MDA含量低于模型组，表明黑果腺肋花楸黄酮提取物可增强小鼠机体抗氧化能力，具有一定体内抗氧化特性。

高剂量组AST、ALT活性较模型组略微下降，保肝效果不如低剂量组明显。GSH-Px活性（p<0.01）与TAOC较模型组有提升，也可进一步证实提取物的体内抗氧化性能。

药物组AST活性均显著高于正常组与模型组（p<0.01），ALT活性小于模型组，GSH-Px活性均显著高于正常组与模型组（p<0.01），MDA含量较模型组也有所降低，体内总抗氧化能力低于模型组，可知本实验所用药物无法对小鼠起到保肝作用，也无法显著提升小鼠机体抗氧化能力。

2.4 黄酮提取液对酒精肝损伤小鼠肝组织病变的影响

小鼠肝组织切片电镜检测结果见图1。

图1 显微镜下5组小鼠肝组织切片Fig.1 Hepatic tissue sections examined under microscope of mice in five groups

由图1 a可见小鼠肝组织结构完整，肝索排列整齐呈放射状分布，肝小叶及细胞核结构清晰，无显著病变状况；由图1b可见小鼠部分肝小叶结构被破坏，细胞损伤严重，出现水肿现象，且肝索排列紊乱不齐，符合急性酒精肝损伤特征；图1c及图1d中小鼠肝组织结构清晰，肝索排列整齐，呈放射状分布，细胞损伤状况明显改善、坏死细胞减少；图1e与图1b相比，仍可见部分肝小叶被破坏，仍有细胞损伤、水肿现象，肝索排列无改善。结果表明，高、低剂量的黑果腺肋花楸黄酮提取物均可改善小鼠急性酒精肝损伤状况，证实其具备保肝功效。而水飞蓟素无明显预防小鼠酒精肝损伤的功效。

3 结论

本研究结果表明，低剂量饲喂黑果腺肋花楸黄酮提取物可明显缓解小鼠肝组织AST及ALT活性的升高，低、高剂量均可改善血清中AST及ALT活性升高，证实黑果腺肋花楸黄酮提取物有保肝和修复酒精引起的急性肝损伤功效，功效与其浓度相关，浓度过高时，功效减弱。肝组织病理观察证明，不同剂量黑果腺肋花楸黄酮提取物均对小鼠急性酒精肝损伤有良好修复作用。而水飞蓟素对小鼠无保肝功效。低剂量提取物可提升小鼠肝组织及血清中GSH-Px活性和TAOC，且降低肝组织中MDA含量，证明黑果腺肋花楸黄酮提取物可以增强机体抗氧化能力，具备体内抗氧化特性，其抗氧化性能与浓度相关，浓度过高会降低其体内抗氧化能力。而水飞蓟素无法显著提升小鼠机体抗氧化能力。