乳酸菌富硒特性及生物活性的研究进展

焦璐，巨家升，周连玉，马学兰

（青海师范大学生命科学学院，青海省青藏高原药用动植物资源重点实验室，青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，青海 西宁 810008）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一种革兰氏阳性异养型细菌，能够利用碳水化合物发酵产生乳酸[1]。常见的种属包括乳酸杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）等。而乳酸菌在生长过程中会产生各种酸、胞外多糖、氨基酸等代谢产物，这些物质具有增强免疫力、抑菌、维持肠道菌群平衡等功效[2-3]。

硒是人体和动物必需矿质元素之一，具有增强免疫力、抗癌、抗氧化等生理功能[4-5]。硒的价态一般为元素硒（0）、硒化物（Ⅱ）、亚硒酸盐（Ⅳ）和硒酸盐（Ⅵ），其化学形式影响着功能的发挥[6]。一些研究者通过生物富集法将有毒性的无机硒转化为有机硒，这样就降低无机硒的毒副作用，并提高了硒的生理活性和吸收率[7]。乳酸菌作为人体内的益生菌，被诸多研究证实了具有硒富集及转化硒的能力，其富硒代谢产物具有多种生理功能。

1 乳酸菌富硒能力与影响因子

乳酸菌具有不同的富硒能力，其富硒率又与多种环境因素有关。将植物乳杆菌分别接入浓度为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL的亚硒酸钠溶液的改良液体培养基（deman rogosa sharpe，MRS）中培养，发现富硒率先随硒浓度增加而升高，当亚硒酸钠浓度为5 μg/mL时富硒率达到最高值34.91%；而当硒浓度超过5 μg/mL时富硒率下降至26.40%[8]。植物乳杆菌在适宜的亚硒酸钠浓度下才能表现出最大的富硒能力。将同种乳酸菌培养在添加6 μg/mL亚硒酸钠的改良MRS液体培养基中，梁金钟等[8]与曾议霆等[9]研究得到的富硒量分别为634.76 μg/g和 425.79 μg/g；可能与各自培养时间不同有关联，前者培养36h，而后者培养了24h。

培养基中的氮源、碳源和矿质元素为菌株生长提供营养成分和能量物质，选择适宜的培养基成分可促进乳酸菌增殖能力和富集能力。通过优化培养基中碳源、氮源、缓冲盐和硒的浓度，发现植物乳杆菌在含有2%葡萄糖、3%牛肉粉∶酵母粉（1∶2）、0.6%磷酸氢二钾、4 μg/mL硒浓度的培养液中培养，活菌数可达到4.9×109cfu/mL，富硒率为52.5%[10]。而将同种乳酸菌培养在添加相同硒浓度不同配方的液体培养基中，其富硒率存在差异。王洋等[11]将动物双歧杆菌01加入硒浓度为8 μg/mL的南瓜汁培养基中培养24 h，其富硒率仅为6.41%，而靳志强等[12]利用改良MRS液体培养基富硒培养动物双歧杆菌01，所得富硒率为22.4%。王洋等[11]利用南瓜汁培养基对多种双歧杆菌菌株进行富硒培养，发现各种菌株富硒率变化范围为1.76%～6.41%。此结果说明了在相同的培养基中同种乳酸菌的不同菌株富硒能力也存在差异，这可能是由于不同菌株之间的基因型存在差异性而导致的。

不同时期的乳酸菌对培养液中物质的吸收能力表现出差异性。分别将一定量的亚硒酸钠溶液在动物双歧杆菌 01培养初期（0 h）、对数生长期（4、6、10 h）以及稳定期（14 h）加入MRS液体培养基中，结果表明，于6 h加入亚硒酸钠得到菌体硒含量和细胞硒转化率均达到最大值，分别为969 μg/g和22.4%[12]。由此可见，乳酸菌在对数期表现出旺盛的活力，有利于吸收硒和转化无机硒。富硒鼠李糖乳杆菌同样在对数期第6小时加硒，富硒率约65%[13]，与靳志强等[12]研究结果相比增加了42.6%，可能是与菌株不同有关。乳酸菌的富硒能力与其培养时间有关，董晓芬等[14]从枳椇果梗中筛选出一株富硒能力强且适宜发酵枳椇液的屎肠球菌，发现当培养时间为3、15、21 h时分别表现出菌株的对数生长期、稳定期和降解期，而当培养时间为15 h～18 h时菌株的生长情况良好，在最适条件下培养富硒率可达39.06%。

乳酸菌在生长代谢过程中产生的酸降低培养液中pH值[15]，而大量的氢离子影响硒离子与细胞表面的结合，从而使菌体的富硒率降低[16]。分别调节硒浓度为5 μg/mL 的 MRS 液体培养基的 pH 值为 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，然后接入植物乳杆菌，试验结果显示菌体富硒量先随pH值升高而增加，当pH值为5.5时达到最高值为739.544 μg/g；而超过pH5.5时，富硒量呈下降趋势[8]。利用同种乳酸菌培养在添加相同亚硒酸钠浓度和接种量的番茄汁液体培养基中，得到的富硒率分别为62.22%和72.17%[17-18]，其差异可能与各自pH值有关，前者pH值为6.6，后者pH值为6.8。这些研究证实了培养液的pH值过高过低都会抑制乳酸菌富硒能力。另外，通过测定培养液pH值来确定加硒的浓度范围。朱何东等[19]将布氏乳杆菌分别接种到含Na2SeO3溶液 40、45、50 μg/mL 的培养液中培养，通过测定培养液pH值来判断菌体是否正常产酸，结果表明在Na2SeO3浓度为40 μg/mL～50 μg/mL条件下菌体产酸正常。

接种量和种龄在一定程度上对乳酸菌富硒能力有影响。接种量过多，乳酸菌繁殖过盛导致发酵液营养缺失，生物量减少；接种量过少，乳酸菌生长缓慢，影响发酵时间。李艳娇等[20]通过比较不同的接种量对乳酸菌富硒量的影响，研究发现富硒量先随接种量升高而增加，当接种量为9%时富硒量达到最高值8 g/L，而接种量超过9%时，富硒量呈下降趋势。乳酸菌种龄时间过长或过短均会出现生长缓慢或衰老等现象。据研究报道接入种龄为9 h～15 h的乳酸菌，其富硒量和富硒能力均较高，而种龄低于9 h或高于15 h，乳酸菌生长不佳[21]。因此在实践中应选择适宜的接种量和种龄来提高乳酸菌富硒能力。

硒浓度、加硒时间、培养时间、pH值、接种量和培养基等诸多培养条件都影响着乳酸菌的富硒能力，各因素之间存在着相互作用。通过响应面及等高线分析可知，加硒时间与接种量、初始pH值与接种量两两之间具有良好的交互作用，根据二次多项回归模型方程得到最优富硒培养条件为加硒时间7.59 h、初始pH5.43、接种量3.26%[8]。徐颖等[13]报道了影响鼠李糖乳杆菌富硒率大小的主次因素依次为加硒时间、硒浓度和培养温度。此外，培养温度、接种量、硒浓度、培养温度与接种量之间的一次交互作用是影响乳酸菌富硒量的主要因素[21]。以富硒率为指标，需要选择多种因素的试验设计方案来优化乳酸菌富硒培养条件，有利于找出富硒最佳的培养条件，以提高乳酸菌的富硒能力。

2 乳酸菌转化硒形态及含量

乳酸菌可以吸收无机硒，经过菌体代谢将不同价态的无机硒转换成不同形态的有机硒，如硒蛋白、硒多糖、硒核酸等，以及单质硒。其中硒蛋白主要包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等，乳酸菌转化硒形态见表1。

表1 乳酸菌转化硒的形态Table 1 Biotransformation of selenium by lactic acid bacteria

梁佳等[22]对双歧杆菌进行富硒培养后，发现菌体含硒氨基酸为硒代蛋氨酸，占总硒含量的（59.55±0.13）%。另外，在酸奶中加入亚硒酸钠，通过电感耦合等离子体质谱法发现，乳酸菌可将其转化为硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸，含量范围分别为69 ng/g～542 ng/g和90 ng/g～272 ng/g[23]。

许多微生物能将培养系统中的无机硒进行富集后，使其与多糖分子结合形成硒多糖。曾议霆[24]对富硒优势菌株植物乳杆菌BC-25进行富硒培养后，采用乙醇沉淀法获得324.80 mg/L胞外硒多糖。经过层析柱分离纯化以及进行红外光谱扫描发现，胞外硒多糖在1 064 cm-1处有多糖的特征吸收峰。通过核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）1H NMR、13C NMR 结果显示，Se可能取代了-OCH3上的CH3形成了Se=O和C-Se-C。

目前国内对富硒乳酸菌硒核酸的研究较少，但对硒的赋存形态及分布有所报道。靳志强[25]对双歧杆菌01进行富硒培养后，采用不同方法分离富硒菌体中的有机硒并测定其占有机硒含量，结果发现双歧杆菌含有硒蛋白、硒多糖和硒核酸含量大小依次为50.7%～63.0%、9.62%～18.70%和0.273%～0.754%，这与富硒肠球菌中有机硒分布相似[26]。

当处于高硒浓度时，许多乳酸菌能将其转化为硒单质（纳米硒）[13，27-29]。亚硒酸钠浓度超过菌体适应范围，无机硒无法完全转化为有机硒进而生成红色的单质硒，这是细胞的一种解毒反应，又叫红硒现象[27]。杨靖鹏等[30]在研究中发现，对保加利亚乳杆菌WY10富硒后，菌体在亚硒酸钠浓度≥80 μg/mL时呈现为红色，并经显微观察菌体细胞周围及表面出现颗粒状的纳米硒。王翼雪[31]对植物乳杆菌富硒后得到直径为（192.28± 26.34）nm 的球状纳米硒。Kheradmand等[32]发现富硒胚芽乳杆菌将二氧化硒转化为单质硒，分布于菌体周围形成纳米微球。结合上述研究结果，乳酸菌菌体表面分布着纳米硒，而菌体内积累多种形态的有机硒，因而对于乳酸菌富硒规律及纳米硒与有机硒的分布还有待进一步研究。

3 富硒乳酸菌及有机硒的生物活性

富硒乳酸菌及其有机硒具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤、提高免疫力、延缓衰老、促进生长等多种生物活性，具体生物活性见表2。

表2 富硒乳酸菌的生物活性Table 2 Biological activities of selenium-enriched lactic acid bacteria

3.1 抗氧化活性

硒在细胞内通过谷胱甘肽过氧化物酶发挥抗氧化功能。Khan等[39]通过动物试验发现口服富硒益生菌制剂（嗜酸乳杆菌和酿酒酵母）能够降低丙二醛含量，升高谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。通过体外抗氧化试验发现动物双歧杆菌01硒蛋白清除羟基、DPPH自由基的活性明显高于其蛋白（P<0.05）。乳酸乳球菌富硒培养后产生的硒多糖对羟自由基和超氧阴离子的清除率比多糖提高约20%，且提高谷胱甘肽过氧化物酶活性[40-41]。这些研究证实了硒与某些有机物结合后能增强其抗氧化活性。

3.2 抗菌活性

一些病原微生物如大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌会引起多种疾病，而滥用抗生素会导致病原菌产生耐药性[42]。Zamare等[43]发现不同的乳酸杆菌经富硒培养后得到的硒纳米，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌活性随着硒纳米浓度的增加而逐渐增强。以接种致病性大肠杆菌的小鼠进行富硒嗜酸乳杆菌试验，与对照组、益生菌、亚硒酸钠进行比较，摄入富硒嗜酸乳杆菌的小鼠死亡率仅为18.75%，低于其它组死亡率43.36%～50.00%；而采用体外混合培养方式的结果表明了与富硒嗜酸乳杆菌共培养时大肠杆菌的数量大幅度减少[44]。此外，Kheradmand等[32]发现乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum和L.johnsonii）富硒发酵液能抑制白色念珠菌的生长，并能将二氧化硒还原成菌体中纳米硒，与非富硒菌体相比，纳米硒菌体明显减少了白色念珠菌的数量。总之，乳酸菌富硒产物以及菌体均能发挥抑菌作用。

3.3 抗癌活性

富硒乳酸菌通过增强巨噬细胞的功能活性，提高谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低脂质过氧化反应，抑制肿瘤坏死因子的释放，防止肝细胞Ca2+浓度急剧升高，从而显著降低CCl4诱导的小鼠肝损伤[45]。给小鼠口服硒纳米（selenium nanoparticle，SeNP）的短乳杆菌后，小鼠的肿瘤生长受到抑制，干扰素-γ和白细胞介素-17水平明显高于对照组（P≤0.05），自然杀伤细胞活性得到极显著提高（P≤0.001）[46]。乳酸菌富硒培养产生的胞外硒多糖（enriched-selenium exopolysaccharide，Se-EPS）能增强刺激巨噬细胞的能力，发挥免疫作用；其与胃癌细胞受体结合后可使细胞内Ca2+浓度逐渐降低，说明了Se-EPS可引起肿瘤细胞发生凋亡，具有显著的抗癌活性[47]。

4 展望

许多乳酸菌具有富集硒的能力，并能将无机硒转化为小分子和大分子的有机硒。而乳酸菌富硒能力与亚硒酸钠浓度、接种量、pH值等多种环境因素有关。乳酸菌遗传特性决定着生理特性，可通过基因工程技术将腺苷三磷酸硫酸化酶（adenosine-triphosphate sulfurylase，ATPS）、谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，ECS）等基因导入菌体中，参与有机硒的转化，以此来提高乳酸菌的富硒能力。乳酸菌能将生存环境下的硒转化成不同硒化合物，硒蛋白的合成与硒代半胱氨酸合酶、硒半胱氨酸特异性延长因子、硒代磷酸盐合成酶等基因表达有关，可以通过检测这几种基因的表达量来间接预测不同乳酸菌合成硒蛋白的能力。在较高浓度的硒溶液中，许多乳酸菌能将硒转化为纳米硒。许多研究证实纳米硒具有活性强、毒性低、吸收好等特点，可作为一种新型的补硒形态，而对纳米硒形成的关键性基因、酶或蛋白质，硒进入乳酸菌的途径及其的转运方式等许多内部还原机理问题等还需不断地研究。