草莓灰霉病病原菌的分离鉴定及室内毒力测定

姜莉莉，田中一久，孙瑞红，宫庆涛，武冲

（1.山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2.山东省现代设施果树技术创新中心，山东 泰安 271000）

草莓（Fragaria ananassaDuchesne）属蔷薇科草莓属多年生草本植物，其果实汁多味美、口感上佳、营养丰富。我国的草莓种植面积及产量均位居世界首位。草莓灰霉病是影响草莓安全生产的重要病害之一，由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引起，可危害植株所有地上部分，其中对花器、果实的侵染最重，导致草莓产量、品质降低，造成严重经济损失。该病原菌由分生孢子随气流、水及农事操作传播，在高湿环境下蔓延迅速［1］。张豫超等［2］报道，湿度是草莓灰霉病发生的诱导因素，随着棚内湿度增加，灰霉病菌孢子萌发率逐渐提高。适当延长设施草莓通风时间，降低棚内相对湿度，可在一定程度上降低草莓灰霉病的发生和危害程度，保障果品质量安全［3］。

目前，化学防治仍是生产上防治植物病害的常用及有效手段［4］。防治草莓灰霉病主要采用苯并咪唑类、甲氧基丙烯酸酯类及甾醇脱甲基抑制剂类杀菌剂。然而，由于长期频繁且不合理用药，草莓灰霉病已对多种杀菌剂产生了不同程度的抗药性，且不同地区差异较大。刘欣等［5］报道，上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性水平及抗性频率较高。贡常委等［6］报道，四川省已有部分地区草莓灰霉病菌对咯菌腈产生了抗药性。赵虎等［7］报道，南京和镇江地区草莓灰霉病菌对咯菌腈未产生抗药性，但对多菌灵、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和醚菌酯产生了多重抗性。

山东省是我国草莓主产区，草莓种植面积及产量均居全国首位。本研究选取8种相对新型的杀菌剂进行室内毒力测定，以期筛选出适用于山东省草莓灰霉病的防治药剂，为草莓安全生产及病害科学防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 病样采集

草莓灰霉病样本于2020年12月采自山东省果树研究所金牛山试验基地草莓大棚，立架式无土栽培，品种为‘香野’。

1.2 供试杀菌剂及来源

95%氟硅唑原药，江苏中旗科技股份有限公司；97%氟环唑原药，江苏辉丰生物农业股份有限公司；95%己唑醇原药，山东潍坊润丰化工股份有限公司；97%吡唑醚菌酯原药，浙江宇龙生物科技股份有限公司；97%苯醚甲环唑原药和98%肟菌酯原药，山东省联合农药工业有限公司；98%咯菌腈原药，河北兴柏农业科技有限公司；97%咪鲜胺原药，山东华阳农药化工集团有限公司。

1.3 草莓灰霉病病原菌分离、纯化

采用病组织分离法［8］将草莓灰霉病病组织剪成小段，75%乙醇中浸泡30 s，无菌水冲洗3次，置于PDA培养基平板上25℃黑暗培养2 d。待菌落形成后，挑取边缘菌丝接种至新的PDA培养基平板上，进一步纯化培养。纯化好的草莓灰霉病菌株以PDA斜面培养基保存备用。

将纯化好的草莓灰霉病病原菌接种至PDA平板上，25℃黑暗培养7 d。以无菌水冲洗菌落，制备草莓灰霉病菌孢子悬浮液，并将孢子浓度调至1×106个／mL。选取移栽2个月、生长正常的盆栽‘香野’草莓植株，以75%乙醇将草莓叶片擦拭干净，以灭菌砂纸轻磨叶片后，接种灰霉病菌孢子悬浮液。采用常规管理，观察病害发生情况。

1.4 病原菌分子鉴定

以真菌基因组DNA提取试剂盒提取草莓灰霉病菌基因组DNA，以ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）为引物进行PCR扩增。扩增体系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2＋Plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol／L each）4μL，ITS1 1.5μL，ITS4 1.5μL，DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U／μL）0.5μL，灭菌水补足至50μL。扩增程序：94℃2 min；98℃10 s，55℃5 s，72℃1 min，30个循环；72℃10 min。扩增产物经回收、纯化后，与pMD18T载体连接、转化，PCR鉴定后，挑取阳性克隆并测序。所得序列与NCBI数据库中序列进行BLAST比对，并构建系统发育树。

1.5 室内毒力测定

采用菌丝生长速率法测定杀菌剂室内毒力［9］。以丙酮将供试原药配制成有效成分浓度为1×104mg／L的母液。在预试验的基础上，对供试药剂母液进行梯度稀释。氟硅唑、氟环唑和己唑醇的试验浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg／L，吡唑醚菌酯和肟菌酯的试验浓度为0.500、1.000、2.500、5.000、10.000 mg／L，苯醚甲环唑的试验浓度为0.250、0.500、1.000、2.500、5.000 mg／L，咯菌腈的试验浓度为0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg／L，咪鲜胺的试验浓度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.500 mg／L。

在超净工作台上，移取1 mL各浓度药液于49 mL灭菌后冷却至50～60℃的PDA培养基中，摇匀后倒板，每浓度制备3个含药PDA平板。从活化好的草莓灰霉病菌菌落边缘打取直径7 mm的菌饼，接种至PDA平板中央，以无菌水处理为对照。25℃黑暗培养，待对照组菌落长至2／3培养皿左右时，采用十字交叉法测定各处理的菌落直径。按照以下公式计算各处理的菌丝生长抑制率（%）；采用SPSS18.0计算各药剂的EC50值和95%置信区间；以活性最低药剂的EC50值为基准值，计算其它药剂的相对毒力指数。

菌丝生长抑制率（%）＝（对照组菌落直径－处理组菌落直径）／（对照组菌落直径－菌饼直径）×100。

2 结果与分析

2.1 草莓灰霉病病原菌鉴定

从草莓灰霉病发病部位分离得到菌株HM－1，在PDA平板上培养4 d后，菌落圆形，呈地毯状平铺，浅白色，气生菌丝绒状（图1）。

图1 草莓灰霉病病原菌HM－1菌落

根据柯赫氏法则，将纯化后的HM－1菌株孢子液接种至草莓健株叶片上，3 d后叶片出现褪绿现象，边缘呈角型干枯，符合灰霉病发病症状（图2）。

图2 HM－1菌株回接症状

采用通用引物ITS1／ITS4对菌株HM－1的rDNA－ITS基因进行PCR扩增后，得到长度为543 bp的DNA序列，GenBank登录号为MZ007846。将该序列在NCBI数据库进行BLAST比对，发现其与葡萄孢属（Botrytis）的同源性为100%。通过构建系统发育树发现该菌株与富克葡萄孢盘菌（Botryotinia fuckeliana）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）聚在一枝（图3），其中富克葡萄孢盘菌为有性世代，灰葡萄孢菌为无性世代，因此将其鉴定为灰葡萄孢菌。

图3 菌株HM－1 ITS序列系统发育树

2.2 8种杀菌剂对草莓灰霉病菌菌丝生长的抑制率

由表1可知，8种相对新型杀菌剂对草莓灰霉病菌菌丝生长抑制活性均较高。其中咯菌腈对草莓灰霉病菌的抑制效果最佳，有效成分浓度为0.050～1.000 mg／L时，对菌丝生长的抑制率为5.11%～74.57%。有效成分浓度为0.125～2.000 mg／L时，氟环唑对草莓灰霉病菌菌丝生长的抑制率为15.75%～68.00%，氟硅唑为14.11%～65.50%，己唑醇为8.74%～66.07%；咪鲜胺浓度为0.125～2.500 mg／L时，对草莓灰霉病菌菌丝生长的抑制率为7.91%～76.28%，抑菌活性也较高。苯醚甲环唑有效成分浓度为0.250～5.000 mg／L时，对草莓灰霉病菌的抑制率为7.21%～79.21%。有效成分浓度为0.500～10.000 mg／L时，吡唑醚菌酯对草莓灰霉病菌菌丝生长的抑制率为17.28%～67.30%，肟菌酯为10.24%～75.54%。

2.3 8种杀菌剂对草莓灰霉病菌的室内毒力

由表2可知，8种相对新型杀菌剂对草莓灰霉病菌的室内毒力均较高。其中吡唑醚菌酯对草莓灰霉病菌的室内毒力最低，EC50值为3.772 mg／L；咯菌腈对草莓灰霉病菌的室内毒力最高，EC50值为0.461 mg／L，相较于吡唑醚菌酯的相对毒力指数为8.182。氟环唑、氟硅唑、咪鲜胺和己唑醇对草莓灰霉病菌的室内毒力也较高，EC50值分别为0.789、0.961、0.991、1.102 mg／L，相对毒力指数分别为4.781、3.925、3.806和3.423。苯醚甲环唑和肟菌酯对草莓灰霉病菌的EC50值分别为1.781 mg／L和3.705 mg／L，相对毒力指数分别为2.118和1.018，抑菌活性较其它几种杀菌剂略差。

表2 8种杀菌剂对草莓灰霉病菌的室内毒力

3 讨论与结论

灰霉病是草莓生产过程中的一种重要病害，严重影响其产量和品质。草莓灰霉病病原菌具有遗传变异性大、繁殖速率高和适应性强等特点，生产上单一、频繁用药极易导致抗药性的产生［10］。为丰富生产上药剂品种的选择，同时延缓抗药性的产生，本研究选取了8种相对新型的杀菌剂，对分离得到的草莓灰霉病菌（B．cinerea）HM－1进行室内毒力测定。结果表明，供试8种杀菌剂对草莓灰霉病菌的室内毒力均较高。其中咯菌腈对草莓灰霉病菌的室内毒力最高，EC50值为0.461 mg／L。氟环唑、氟硅唑、咪鲜胺和己唑醇对草莓灰霉病菌的室内毒力也较高，EC50值分别为0.789、0.961、0.991、1.102 mg／L。这与尹向田等［11］报道的不同种类杀菌剂对葡萄灰霉病菌的室内毒力结果相近。

咯菌腈属于苯吡咯类非内吸性杀菌剂，防病谱较广，主要通过抑制菌体葡萄糖磷酰化反应抑制病原菌的生长，从而导致病原菌死亡。氟环唑、氟硅唑和己唑醇为三唑类甾醇抑制剂类杀菌剂，咪鲜胺属于咪唑类甾醇抑制剂类杀菌剂，均通过抑制病原菌麦角甾醇的合成，使菌体细胞膜功能受到破坏［12］。本研究发现，咯菌腈、氟环唑、氟硅唑、咪鲜胺和己唑醇对草莓灰霉病菌的室内毒力均较高，生产上可用于防治该病害。同时，还可通过及时摘除衰老花瓣［13］，加强通风透光等农业防治手段，降低草莓灰霉病的发生和为害。