60Co－γ射线诱变创制苦荞品系的黄酮和蛋白质含量分析

石桃雄，关志秀，韦春玉，李红兴，汪燕，梁成刚

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心，贵州 贵阳 550001）

荞麦是双子叶蓼科荞麦属（FagopyrumMill）植物，包含甜荞（F．esculentumMoench）与苦荞［F．tataricum（L.）Gaertn］两个栽培种［1，2］。荞麦的种子蛋白质含量较高，且富含芦丁等黄酮类物质，是我国重要的杂粮作物［1，2］。早在1946年甜荞种子就被认为是提取芦丁的优质原料，而苦荞芦丁含量一般为甜荞的3～5倍，保健价值更为突出［3－5］。历史上苦荞是彝族人民的主粮，也可作为一种救灾填闲作物［6］。苦荞种子蛋白质以清蛋白和谷蛋白为主，这与水稻等谷物的种子蛋白质组分比例不同，且苦荞种子蛋白质中赖氨酸含量丰富，比例合理，适宜人体吸收利用［7，8］。近来随着研究的不断深入，越来越多的证据表明苦荞种子黄酮对于“三高”人群的疗效显著，因此，围绕种子黄酮开展的品质及保健功能研究等较多［8，9］。苦荞种子多酚成分及比例与水果多酚相似，而与玉米等谷物不同，苦荞总多酚含量与自由基清除能力呈线性相关［10－12］。目前普遍认为，苦荞中活性物质不仅对2型糖尿病具有较好的辅助治疗效果，还具有较强的清除自由基能力以及抗氧化活性［8－14］。随着生活水平的日益提高以及人们对苦荞营养与保健功效的认识，苦荞产品越来越受到广大消费者的追捧。

目前，苦荞杂交育种工作开展缓慢，主栽品种大多是以常规育种方法育成［15］。辐射诱变育种是苦荞高产优质育种较为常用的方法之一［16］。晋荞麦2号是原山西省农业科学院选育的高产优质国审苦荞品种［17］。对晋荞麦2号进行引种发现，在贵州地区晋荞麦2号不仅表现出高产、稳产特性，而且具有总黄酮含量较高等特性［18］。此外，低氮与低磷处理发现，晋荞麦2号为耐低氮、磷高效品种［7，19］。因此，本课题组以晋荞麦2号为材料进行60Co－γ射线辐射诱变，创制突变种质资源，以期为下一步苦荞的高产优质育种以及基因功能研究提供材料。本研究即选用其中单株产量较高的株系为材料，对其种子的主要营养与保健成分进行检测，为今后苦荞的优质育种以及产品加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年以晋荞麦2号为材料，使用60Co－γ射线（200、400、600 Gy）对30 000余粒种子进行辐射诱变。本试验即以诱变创制的49份具有高产潜力的M6代种子为材料，以野生型晋荞麦2号（JQ2）为对照。供试材料见表1。

表1 供试材料及编号

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理 将各品系种子分为3份，置于60℃烘箱中烘干，冷却后去壳，并用粉碎机粉碎，过100目筛，供品质指标测定使用。

1.2.2 总黄酮与总多酚含量的测定 称取0.05 g样品于2 mL离心管中，加入80%的乙醇1.5 mL并振荡摇匀，在70℃下浸取5 h（期间振荡摇匀5次），再利用超声提取10 min，最后在2 000 r／min下离心2 min，取上清液，待测。总黄酮的测定参考汪燕等［7］的方法，以芦丁标准溶液制作标准曲线进行计算；总多酚含量的测定参考孙丹等［20］的方法，以没食子酸标准溶液制作标准曲线进行计算。

1.2.3 蛋白质组分的测定 参考汪燕等［7］的方法，称取0.10 g样品置于瓷研钵中，依次加入清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白提取液进行提取并测定。

1.3 数据分析

使用Microsoft Excel 2010进行数据整理，用SPSS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞种子总黄酮含量的分析

由表2可知，49份苦荞材料的种子总黄酮含量在7.55～32.05 mg／g间，平均为20.52 mg／g总黄酮含量高于20.00 mg／g的材料有32份，低于10.00 mg／g的材料有7份，显著或极显著高于对照的材料有19份，极显著低于对照的材料有13份。其中，LW－16和LW－76的总黄酮含量达到30.00 mg／g以上，为高黄酮含量苦荞材料较对照分别提高52.28%和52.47%；LW－69的总黄酮含量为7.55 mg／g，为低黄酮含量苦荞材料，较对照降低64.09%。

表2 苦荞种子的总黄酮含量 （mg／g）

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2.2 苦荞种子总多酚含量的分析

由表3可知，49份苦荞材料的种子总多酚含量在4.55～11.76 mg／g之间，平均含量为8.21 mg／g。总多酚含量为10.00 mg／g及以上的材料有4份，低于5.00 mg／g的材料有1份，含量显著或极显著高于对照的材料有4份，显著或极显著低于对照的材料有7份。其中LW－52和LW－57为高多酚苦荞材料，总多酚含量达到11 mg／g以上，较对照分别提高35.50%和39.17%；LW－16总多酚含量为4.55 mg／g，为低多酚苦荞材料，较对照降低46.15%。

表3 苦荞种子的总多酚含量 （mg／g）

2.3 苦荞种子蛋白质组分含量的分析

由表4可知，49份苦荞种子总蛋白含量在55.51～116.08 mg／g之间，平均88.85 mg／g。其中，LW－57和LW－17种子总蛋白含量分别为116.08 mg／g和110.38 mg／g，较对照分别提高20.34%和14.43%，达显著或极显著水平；12份材料的种子总蛋白含量显著或极显著低于对照，LW－25和LW－46为低蛋白含量苦荞材料，种子总蛋白含量分别为55.51 mg／g和58.49 mg／g，分别较对照降低42.45%和39.36%。

表4 苦荞种子的总蛋白含量 （mg／g）

由表5可知，49份苦荞材料的清蛋白含量在3.24～67.04 mg／g间，变异系数达到31.14%，平均含量为43.31 mg／g，占总蛋白含量的48.75%。其中，LW－25种子的清蛋白含量最低，较对照降低91.63%；LW－37种子的清蛋白含量最高，较对照提高73.29%。

表5 苦荞种子的蛋白质组分含量及比例

49份苦荞材料的球蛋白含量在0.37～6.40 mg／g间，变异系数达到54.08%，平均含量为2.38 mg／g，占总蛋白含量的2.68%。其中，LW－25种子的球蛋白含量最低，较对照降低90.05%；LW－59种子的球蛋白含量最高，较对照提高72.04%。

49份苦荞材料的醇溶蛋白含量在1.42～6.75 mg／g间，平均含量为3.66 mg／g，变异系数达到25.18%。其中，LW－42种子的醇溶蛋白含量最低，较对照降低78.91%；LW－76种子的醇溶蛋白含量最高，较对照提高0.25%。

49份苦荞材料的谷蛋白含量在25.59～63.32 mg／g间，平均含量为39.50 mg／g，变异系数达到25.54%。其中，LW－42种子的谷蛋白含量最低，较对照降低45.93%；LW－17种子的谷蛋白含量最高，较对照提高33.80%。

2.4 苦荞种子主要营养与保健成分的相关性分析

对苦荞种子主要营养与保健成分含量进行相关性分析，结果（表6）发现，苦荞种子总多酚含量与清蛋白含量（0.347**）和总蛋白含量（0.322**）呈极显著正相关；总黄酮含量与醇溶蛋白含量（0.226**）和谷蛋白含量（0.178*）呈极显著和显著正相关，与球蛋白含量（－0.445**）呈极显著负相关；清蛋白含量与总蛋白含量（0.714**）呈极显著正相关，与谷蛋白含量（－0.282**）呈极显著负相关；醇溶蛋白含量与谷蛋白含量（0.243**）和总蛋白含量（0.162*）呈极显著或显著正相关；谷蛋白含量与总蛋白含量（0.462**）呈极显著正相关。

表6 苦荞种子总黄酮、多酚和蛋白质组分的相关性分析

3 讨论与结论

苦荞种子富含黄酮类生物活性成分，不仅具有降血糖、降血压、降血脂等显著疗效，在清除自由基能力以及抗氧化等方面也具有明显效果［8－14］。吕丹等［21］研究表明，212份苦荞种质总黄酮的含量范围为1.02%～2.84%，平均值为2.05%。本研究发现辐射诱变对苦荞种子总黄酮含量影响较大，49份苦荞材料的总黄酮含量在7.55～32.05 mg／g间，与野生型晋荞麦2号比，19份材料种子总黄酮含量显著或极显著提高，13份材料极显著降低。其中，LW－16和LW－76为高黄酮含量苦荞材料，LW－69为低黄酮含量苦荞材料，可作为优质育种或次生代谢研究的重要材料。

苦荞种子多酚含量与抗氧化活性密切相关，苦荞多酚不仅能改善内皮胰岛素抵抗，另外其游离酚提取物还能显著抑制人结肠癌细胞增殖［10－12］。本研究发现，辐射诱变对苦荞种子多酚含量影响较大，49份材料的总多酚含量在4.55～11.76 mg／g之间，显著或极显著高于对照的有4份，显著或极显著低于对照的有7份。其中LW－52和LW－57为高多酚品系，可作为苦荞优质育种的重要候选材料。

苦荞蛋白质含量较高，氨基酸比例均衡，营养价值高，适宜人体吸收利用［22］。除此之外，Zhang等［13］研究发现苦荞蛋白还具有降血脂等保健功效。李红梅［14］和汪燕［7］等研究发现苦荞种子蛋白质组分以清蛋白与谷蛋白为主，本研究也发现苦荞种子蛋白质组分中清蛋白与谷蛋白含量最高。体外抗氧化能力研究发现，苦荞种子蛋白质组分中清蛋白和球蛋白具有抑制超氧阴离子自由基产生和清除羟自由基等功效［14］。不过，苦荞种子球蛋白含量较低，平均为总蛋白的2.68%，因此，选育高清蛋白含量品种可作为苦荞优质育种的重要目标。本研究发现，LW－37种子清蛋白含量达到67.04 mg／g，较对照提高73.29%，可作为苦荞优质育种的重要候选材料。

苦荞是我国重要的杂粮作物，其种子富含蛋白质以及芦丁等黄酮类物质，具有较高的营养保健价值和食疗功效［5，6］。苦荞优质育种非常重视种子中蛋白质、总黄酮含量等指标。苯丙氨酸不仅是合成蛋白质的重要氨基酸，也是黄酮类次生代谢物的主要前体物质［23］。相关性分析结果表明，苦荞总蛋白、清蛋白含量与总多酚含量呈极显著正相关，谷蛋白、醇溶蛋白含量与总黄酮含量呈显著或极显著正相关，说明选育兼具高蛋白、高黄酮和高多酚含量的苦荞品种具有可能性。

受限于苦荞花朵小、杂交工作开展较难等因素，苦荞杂交优质育种研究进展较为缓慢［15，16］。本研究利用60Co－γ射线对苦荞进行辐射诱变，发现49份材料种子总黄酮含量的变异系数达到35.52%，总多酚含量的变异系数达到19.27%，总蛋白含量的变异系数达到16.24%，说明60Coγ射线辐射诱变可为苦荞优质育种的有效途径；而且60Co－γ射线辐射创制的营养成分含量发生极端变化的材料，如LW－25为低清蛋白和球蛋白材料，可为苦荞的基因功能研究提供材料。