基于分子对接和内质网应激探讨老鼠簕生物碱A对小鼠急性肝损伤的作用*

梁英琴，徐万鹏，王红园，韦秀桂，孙雪梅，周焕芳，张 华，林 军

（1.广西医科大学药学院,南宁 530021；2.广西医科大学附属肿瘤医院药学部,南宁 530021）

肝脏是人体的重要器官，具有代谢、解毒和免疫等功能。当肝脏受到病毒、酒精和药物等毒素和外源性物质刺激时，可引起肝细胞损伤，从而触发炎症导致细胞坏死，构成肝脏疾病的重要发病基础[1]。肝损伤是一种严重的临床综合征，预后较差，可导致极高的死亡率，严重危害人民群众的生命健康。脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌产生的一种内毒素，具有引起巨噬细胞活化和强致炎作用，是造成肝脏损伤的重要药物之一。研究表明，LPS 可引起小鼠体内氧化应激和炎症，造成肝脏损害[2]。

肝脏中富含内质网（endoplasmic reticulum，ER），ER 是细胞加工脂质、蛋白质和贮存钙离子的主要场所，也负责细胞外空间中蛋白的合成、修饰和释放[3]。当肝脏受到损伤时，肝细胞内环境平衡遭到破坏，蛋白质的正确折叠受阻，未折叠或错误折叠的蛋白质积聚在内质网中，从而诱发内质网应激（ERS）。近年来相关研究发现，ERS 可能是多种肝脏疾病的发病机制之一，受损的肝细胞可触发ERS 并导致肝细胞死亡[4]。因此，寻找减轻或者抑制ERS的有效药物，对于肝脏疾病的治疗具有重要意义。

老鼠簕生物碱A（4-羟基苯并噁唑-2-酮，HBOA）是本课题组从药用红树林植物老鼠簕（Acanthus ilicifolius L.）中提取出的一种活性单体[5]。本课题组前期研究结果表明，HBOA 具有良好的减轻炎症、抗肝纤维化的作用[6]，但对于LPS所致小鼠急性肝损伤ERS的作用还不明确。因此，本研究采用LPS建立小鼠急性肝损伤模型，从而评估HBOA对肝损伤所致的EPS的潜在影响及机制。

1 材料与方法

1.1 药物和主要试剂 HBOA 由广西医科大学药学院药物化学教研室合成，纯度＞98%。LPS（北京索莱宝科技有限公司）；联苯双酯滴丸（北京协和药厂）。乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒、谷胱甘肽（GSH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；增强型BCA蛋白浓度检测试剂盒（碧云天生物技术公司）；磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、C/EBP 同源体蛋白（CHOP）、半胱天冬酶12（Caspase-12）抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）抗体、白细胞介素1β（IL-1β）（博士德生物工程有限公司）；二抗（美国LICOR公司）。

1.2 主要仪器 连续光谱扫描式酶标仪（美国Thermo Fisher公司）；双色红外激光成像系统（美国Odyssey LI-COR公司）；MICRO17R小型离心机（赛默飞世尔科技有限公司）；SWB-20L-1恒温摇床（美国Major Science 公司）；Olympus BX53 正置荧光显微镜；Nanodrop3000 微量核酸蛋白分析仪（美国Thermo Fisher 公司）；MP-300V 电泳仪（美国Major Science 公司）。

1.3 实验动物 SPF 级健康KM 雄性小鼠，体重18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为：SCXK（桂）2020-0003，使用许可证号为：SYXK（桂）2020-0004。小鼠饲养环境控制温度为（23±2）℃，相对湿度为50%～70%，12 h/12 h光/暗循环。

1.4 分子对接 先从PubChem 数据库获取HBOA的三维分子结构，RCSB PDB数据库（http://www.rcsb.org/）获取GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白质三维结构PDB格式。通过Pymol 2.4软件对各分子进行去掉水分子、计算电荷等操作。其次使用Auto Dock Tools 1.5.6 软 件将HBOA 和GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白结构的PDB 格式文档均转化为PDBQT 格式后进行分子对接。最后通过Pymol 软件分析对接结果并进行可视化分析，筛选出最优对接构象。

1.5 动物分组及急性肝损伤模型的建立 将小鼠随机分为6 组：正常组、模型组（LPS，10 mg/kg）、联苯双酯阳性药组（150 mg/kg）及HBOA 高、中、低剂量组（200 mg/kg、100 mg/kg、50 mg/kg），每组10 只。药物采用0.6%CMC-Na助溶，正常组和模型组小鼠用溶剂CMC-Na 灌胃，其余各组用相应药液灌胃，1 次/d，连续灌胃10 d。末次给药禁食不禁水12 h，除正常组外，其余各组均腹腔注射LPS（10 mg/kg）建立肝损伤模型。

1.6 样本采集与处理 腹腔注射LPS 6 h 后，乙醚麻醉并颈椎脱臼处死小鼠，取出肝脏并用预冷的生理盐水洗净表面，滤纸吸干表面液体，称取湿重量。切取每只小鼠的同一位置的肝脏小叶固定于4%多聚甲醛溶液中，剩下的肝脏分为4 份，保存于-80 ℃冰箱中。

1.7 肝脏LDH、GSH含量检测 将肝脏从-80 ℃冰箱取出，解冻，用预冷的生理盐水将其洗涤干净。用滤纸将黏附在组织上的生理盐水吸干后，切取适量组织，严格按照试剂盒说明书，对小鼠肝组织中LDH、GSH含量进行测定。

1.8 免疫组化法检测肝组织中IL-1β水平 肝组织切片经二甲苯脱蜡、水化后，加入柠檬酸修复液，3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，10%山羊血清封闭，滴加一抗IL-1β（1:500），4 ℃条件下孵育过夜；次日加入二抗（1:10 000），37 ℃下孵育0.5 h，随后滴加DAB 显色液，苏木精复染，封片，置于显微镜下观察、拍照，细胞质内棕黄色颗粒表示蛋白阳性表达。用Image Pro plus 6.0 软件分析IL-1β 蛋白表达量，以平均光密度值表示蛋白的相对定量（平均光密度值=累积光密度值/阳性面积）。

1.9 Western blotting 法检测肝组织中GRP78、CHOP、Caspase-12、TNF-α 和IL-6 的表达 采用液氮从小鼠肝组织中提取出蛋白液，BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。按蛋白样本：SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）=1∶4 的比例将其混匀后，沸水中煮5 min变性。蛋白样品采用10%十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离1.5 h，后转膜1.5 h 使蛋白转移到PVDF 膜上。将PVDF 膜置于TBST 中洗涤3 次，每次5min，然后转移到一抗中4 ℃下孵育过夜：GAPDH（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、CHOP（1∶800）、Caspase-12（1∶800）、TNF-α（1∶1 000）、IL-6（1∶1 000）。孵育过夜的膜再用TBST 洗涤3 次后，放于二抗（1:10 000）中室温孵育1 h，最后再用TBST 洗涤3 次，立即用Odyssey 扫膜仪进行扫膜，用Image J2X 软件分析蛋白条带灰度值。以GAPDH 为内参，目的蛋白条带与相应内参条带灰度值的比值为蛋白相对表达量。

1.10 统计学方法 采用SPSS 21.0软件分析数据，计量资料用均数标准差（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 分子对接结果 HBOA 与ERS 标志性蛋白GRP78 之间的结合能为-5.77 kcal/mol，HBOA 可与活性位点附近的GLU-202、ASP-35、THR-230、GLY-229、GLY-228、THR-38 这6 个氨基酸形成氢键结合到GRP78；HBOA 与TNF-α 之间的结合能为-5.83 kcal/mol，其可与活性位点附近VAL-150、LEU-93、HIS-15 这3 个氨基酸形成氢键结合到TNF-α；而HBOA与IL-1β之间的结合能为-5.48 kcal/mol，其可与活性位点附近LEU-26、LEU-82 这2 个氨基酸形成氢键结合到IL-1β；HBOA 与IL-6 之间的结合能为-5.36 kcal/mol，其可与活性位点附近VAL-154、PRO-152、LYS-85 这3 个氨基酸形成氢键结合到IL-6，见图1。

图1 HBOA与GRP78、IL-1β、TNF-α、IL-6对接后的最优构象图

2.2 HBOA 对小鼠肝组织中LDH、GSH 水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝脏中LDH含量显著升高，GSH水平显著降低（均P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组和HBOA 高、中剂量组中LDH 含量显著降低（P＜0.01），而阳性药组和HBOA各剂量组中GSH含量显著升高（P＜0.01），见表1。

表1 HBOA 对LPS 诱导的急性肝损伤小鼠肝组织LDH、GSH水平的影响，n=10

表1 HBOA 对LPS 诱导的急性肝损伤小鼠肝组织LDH、GSH水平的影响，n=10

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

2.3 HBOA对急性肝损伤小鼠肝组织中IL-1β蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝组织中出现大量的棕黄色颗粒，表明IL-1β 蛋白水平明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，HBOA 给药组棕黄色颗粒显著减少，表明IL-1β 蛋白表达水平明显受到了抑制（P＜0.01），见图2。2.4 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6表达水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6 蛋白表达显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，HBOA高、中、低剂量组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6 蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），见图3、表2。2.5 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织GRP78、CHOP和Caspase-12蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组肝组织中的GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达明显增加（P＜0.01）；与模型组比较，HBOA 高、中剂量组均显著降低小鼠肝组织中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达水平（P＜0.01），见图4、表3。

图3 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6 蛋白表达的影响

表2 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6 蛋白表达的影响，n=3

表2 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织TNF-α、IL-6 蛋白表达的影响，n=3

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

图4 HBOA 对急性肝损伤小鼠肝组织GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达的影响

表3 HBOA对急性肝损伤小鼠肝组织GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达的影响，n=3

表3 HBOA对急性肝损伤小鼠肝组织GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达的影响，n=3

与正常组比较，*P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.01。

3 讨论

结合能反映受体与配体之间结合的可能性，结合能的高低能直接反映出受体与配体之间的亲和力和构象稳定性。一般情况下，两分子间的结合能小于0 kcal/mol时，视为有效对接。结合能越低，说明两个分子在自然状态下结合释放的能量越低，即更易于结合。分子对接结果表明，HBOA与ERS标志蛋白GRP78 和炎症相关蛋白（TNF-α、IL-1β、IL-6）之间的结合能均低于-5 kcal/mol，则具有良好的结合能力。以上提示了当炎症和ERS 发生时，HBOA 可能通过抑制GRP78、TNF-α、IL-1β、IL-6 的表达来减轻ERS 和炎症，但需要实验来进一步验证。

LPS 是革兰阴性菌外细胞壁的主要糖脂成分，通常情况下，部分释放的LPS 被门脉循环吸收，继而传递到肝脏后被迅速清除。因此，肝脏在LPS进入机体和代谢调节过程中起着中心作用。LPS可诱导急性炎症及一系列生化变化，如细胞因子和氧化应激增加，线粒体功能障碍，以及器官功能障碍等，与在人体中观察到的变化高度相似，因此LPS常被用于诱导啮齿类动物建立急性肝损伤模型[7]。

LDH水平是肝细胞毒性的一种酶标志物[8]。当肝细胞受损时，细胞膜通透性增加，导致LDH 泄漏增加，因此LDH水平高低在一定程度上反映肝脏的受损程度。本研究中，HBOA 高、中剂量可降低LDH水平，说明HBOA可以对抗LPS对肝脏的毒性作用而达到保肝效果。

抗氧化剂防御系统的损伤是LPS 诱导肝脏损伤的关键环节。有研究表明，LPS 对肝脏的损伤以特征组织病变和循环中抗氧化酶、抗氧化分子水平的变化为特征，如谷胱甘肽(GSH)。GSH 因具有清除自由基和抗氧化的特性，因此被认为是一种高效的抗氧化化合物。GSH对于活性氧具有中和作用，在多种细胞功能的调节过程中至关重要。有研究表明，持续充足的GSH水平可以减轻LPS诱导的肝损伤[9]。本研究发现，模型组小鼠肝组织中GSH 含量显著降低，表明LPS可使小鼠肝脏抗氧化能力降低；与模型组相比，HBOA 各给药组GSH 含量显著升高，提示HBOA在一定程度上逆转了LPS对肝脏抗氧化系统的损害。

LPS引起的肝损伤也与炎症介质紧密相关。据研究，LPS 可能激活转录因子NF-κB 导致许多炎症因子的激活,如TNF-α，IL-1β[10]。TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子通过加速肝细胞凋亡而加重肝损伤，并与肝损伤的严重程度密切相关[11]。分子结果提示HBOA 可能通过与IL-1β、TNF-α、IL-6 蛋白结合，从而抑制炎症反应。免疫组化结果显示，HBOA 预处理可以降低LPS 诱导急性肝损伤小鼠肝组织中IL-1β蛋白水平；此外，Western blotting结果也表明HBOA 可降低模型组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6 蛋白表达水平。提示HBOA 可能通过抑制炎症反应从而对肝脏起到保护作用。

当氧化应激、缺氧、细胞毒性物质等不利因素作用于细胞时，细胞内环境稳态遭受破坏，未折叠或错误折叠的蛋白积聚在内质网中，诱发ERS。ERS介导的凋亡是细胞内源性凋亡途径之一，有研究表明ERS 在急性肝损伤小鼠模型中发挥着重要的调节作用[12]。当发生ERS 时，未折叠蛋白反应（UPR）被激活以恢复内质网稳态，并降低机体损伤。适度的ERS 对细胞具有保护作用，但是，若应激信号严重或延长，内质网就会触发细胞死亡途径[13]。持续的ERS 会导致UPR 下游的促凋亡分子Caspase-12、CHOP 表达增加，引发细胞凋亡[14]。本实验中，分子对接结果表明HBOA与GRP78之间具有较强的结合力。此外，急性肝损伤小鼠肝组织中GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白表达均上调，说明肝损伤过程中伴随着ERS的发生；而HBOA可以抑制这些蛋白的升高，提示HBOA 可以启动UPR 反应，减少未折叠或错误折叠的蛋白在ER 腔内累积，从而恢复内质网的内稳态平衡。

综上所述，HBOA 对LPS 所致的小鼠急性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与恢复肝脏稳态、提高肝脏的抗氧化能力、抑制ERS、减轻炎症、减少肝细胞凋亡等相关。