慢性HIV-1感染者CD8+T细胞活化和耗竭水平与病程的相关性研究*

何天怡，邱文浩，刘 显，彭丽珊，吴展帅，肖 健△

（广西中医药大学 1.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室；2.免疫学与微生物学教研室，南宁 530200）

抗逆转录病毒疗法（antiroviral therapy，ART）是目前治疗HIV-1 感染的有效方法，该治疗方法成功降低了HIV-1病毒对人类的致命性伤害并向慢性疾病转化，延长感染者寿命并提高其生活质量。ART疗法通过清除有复制能力的感染细胞或大幅度提升淋巴细胞的免疫反应来控制HIV-1病毒对人体的损害，但却始终无法将HIV-1 病毒完全根除。在对抗病毒过程中，CD8+T 细胞分化为细胞毒性T 细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL），通过特异性杀伤被HIV-1 病毒感染的细胞来控制感染，因此CD8+T 细胞是治疗HIV-1 感染的关键[1-2]。Kuse 等[3]研究表明，在HIV-1感染的急性期，CD8+T细胞在控制病毒复制方面发挥着重要作用，有助于感染初期的控制[3]。慢性激活和炎症也会影响CD8+T细胞的分化和功能，这对控制HIV-1病毒复制至关重要。同时，Perdomo-Celis 等[4]发现，尽管ART 疗法可以诱导部分免疫重建，但它对CD8+T细胞的细胞毒性功能及其与炎症状态的关系尚不明确。并且经过ART 治疗后，CD8+T 细胞功能尚未恢复及其表面各类共刺激分子的相互作用使得清除病毒变得困难，这也是目前无法研制出有效治疗HIV-1病毒疫苗的原因之一。目前的研究主要基于如何诱导强而有效的病毒特异性CD8+T细胞反应[5-6]。因此，探索不同感染状态下HIV-1感染者外周血CD8+T细胞免疫状态对揭示HIV-1感染机制具有重要意义。在免疫应答过程中，HIV-1病毒复制增强与免疫激活、免疫细胞功能障碍、免疫细胞耗竭和淋巴细胞转移有关。本研究通过检测CD38、HLA-DR 和PD-1 在CD8+T 细胞的表达，从活化与耗竭的角度来探讨CD8+T细胞在HIV-1感染过程中的变化及作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2019年1月至2020年12月在广西疾病预防控制中心和瑞康医院门诊就诊的未经抗病毒治疗的HIV-1 感染者96 例，其中男77 例，女19例；年龄17～86岁，中位年龄34岁，根据CD4+T 细胞计数分为3 组：（1）低CD4+T 细胞计数组53例，其中男45例，女8例，CD4+T细胞计数＜350个/μL；（2）中CD4+T细胞计数组21例，其中男18例，女3 例，CD4+T细胞计数＞350～499 个/μL；（3）高CD4+T 细胞计数组22 例，其中男14 例，女8 例，CD4+T 细胞计数≥500 个/μL。接受抗病毒治疗的HIV-1感染者27例（治疗组），其中男17例，女10例，年龄7～59岁，中位年龄36岁。同期选取健康志愿者30例（健康组），HIV-1阴性，无其他免疫病史及其他免疫治疗史。所有感染者排除乙肝、丙肝等其他病毒合并感染的情况，临床检查亦无其他疾病。本研究获得医院伦理学委员会的批准，所有研究对象对研究内容知情同意，并签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 CytoFLEX 流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司），光学显微镜（德国徕卡公司）。Ficoll人淋巴细胞分离液（美国GE公司）；RPMI-1640培养基（赛默飞世尔仪器有限公司）；Pacific Blue Mouse Anti-Human CD3、BV510 Mouse Anti-Human CD8、PerCP-Cy 5.5 Mouse Anti-Human CD38、Alexa Flour TM 700 Mouse Anti-Human HLA-DR、APC Mouse anti-Human CD279（PD-1）（美国BD公司）。

1.3 外周血单个核细胞（PBMCs）的获取 清晨空腹状态下分别抽取HIV-1感染者和健康对照组外周静脉血4 mL 于EDTA-K2 真空抗凝管中，并加入与抗凝血等体积的RPMI-1640稀释血液；将稀释后的血液平铺到Ficoll 淋巴细胞分离液上（抗凝血-RPMI-1640:Ficoll 液=2∶1），用密度梯度离心法分离PBMCs，经显微镜细胞计数后将细胞浓度调整为1×107个/mL的细胞悬液。

1.4 流式细胞术检测CD8+T细胞CD38、HLA-DR、PD-1 的表达 取1.5 mL 离心管，加入100 μL 调整后的PBMCs悬液，分别加入带有荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD3 PB、CD8 BV510、CD38 PerCP-Cy5.5、HLA-DRAF700、PD-1APC适量，4 ℃避光孵育30 min；经PBS洗涤后用多聚甲醛溶液重悬细胞，用流式细胞仪检测。

1.5 统计学方法 采用Prism Graphpad8.0 统计软件对数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差(）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。采用Pearson 相关性分析法分析同一样本参数之间的相关性，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HIV-1感染者外周血CD8+T细胞CD38的表达情况 低CD4+T 细胞计数组（56.59%±10.55%）、中CD4+T 细胞计数组（55.42%±10.34%）、高CD4+T 细胞计数组（53.09%±8.18%）外周血CD8+T细胞CD38表达均高于治疗组[（38.73±8.32）%]和健康组[（34.73±8.32）%]（均P＜0.01）；低、中、高CD4+T 细胞计数组外周血CD8+T 细胞HLA-DR 表达比较无明显差异（P＞0.05），见图1。

图1 5组外周血CD8+T细胞CD38表达比较

2.2 HIV-1 感染者外周血CD8+T 细胞HLA-DR 的表达情况 低CD4+T细胞计数组[（47.35±9.61）%]、中CD4+T 细胞计数组[（46.73±12.77）%]、高CD4+T细胞计数组[（43.20±11.01）%]外周血CD8+T 细胞HLA-DR 表达均高于治疗组[（29.47±7.53）%]和健康组[（13.38±5.87）%]（均P＜0.01）；治疗组外周血CD8+T 细胞HLA-DR 表达高于健康组（P＜0.01）；低、中、高CD4+T 细胞计数组外周血CD8+T 细胞HLA-DR的表达比较无明显差异（P＞0.05），见图2。2.3 HIV-1 感染者外周血CD8+T 细胞PD-1 的表达情况 低CD4+T 细胞计数组[（43.52±12.15）%]、中CD4+T 细胞计数组[（36.44±12.31）%]、高CD4+T 细胞计数组[（35.54±11.27）%]外周血CD8+T细胞PD-1的表达均高于治疗组[（24.09±7.92）%]和健康组[（13.24±5.93）%]（均P＜0.01）；低CD4+T 细胞计数组外周血CD8+T 细胞PD-1 表达高于高CD4+T 细胞计数组（P＜0.05）；治疗组外周血CD8+T 细胞PD-1表达高于健康组（P＜0.01），见图3。

图2 5组外周血CD8+T细胞HLA-DR表达比较

图3 5组外周血CD8+T细胞PD-1表达比较

2.4 HIV-1感染者CD38+HLA-DR+CD8+T细胞PD-1表达情况 低CD4+T细胞计数组[（49.55±11.16）%]、中CD4+T细胞计数组[（45.42±9.46）%]、高CD4+T细胞计数组[（41.45±7.64）%]外周血CD38+HLA-DR+CD8+T 细胞PD-1 的表达均高于治疗组[（30.18±6.12）%]和健康组[（20.31±5.03）%]（均P＜0.01）；低CD4+T细胞计数组外周血CD38+HLA-DR+CD8+T细胞PD-1 的表达高于高CD4+T 细胞计数组（P＜0.01）；治疗组外周血CD38+HLA-DR+CD8+T 细胞PD-1的表达高于健康组（P＜0.01），见图4。

图4 5组外周血CD38+HLA-DR+CD8+T细胞PD-1的表达比较

2.5 相关性分析 未治疗的HIV-1 感染者外周血CD8+T细胞CD38、HLA-DR表达与CD4+T细胞计数无明显相关性（r=-0.1092，P=0.2897；r=0.0026，P=0.9798）；未治疗的HIV-1感染者外周血CD8+T细胞PD-1 表达与CD4+T 细胞计数呈负相关关系（r=-0.2419，P=0.0176）。

未治疗的HIV-1 感染者CD38+HLA-DR+CD8+T细胞PD-1 的表达与CD4+T 细胞计数呈负相关关系（r=-0.2714，P=0.0075）。

3 讨论

在对HIV-1 病毒免疫反应期间，抗原特异性CD8+T细胞被激活，增殖并获得效应功能，是抑制病毒复制和特异性杀伤被病毒损害的靶细胞的关键，因此CD8+T细胞在针对HIV-1感染的免疫反应中起主要作用[7-8]。在HIV-1 感染过程中，CD38、HLADR，作为共刺激性分子在HIV感染中成为T细胞活化的表征[9]。有研究表明，由CD38和HLA-DR表达在CD8+T 细胞上的活化水平比在CD4+T 细胞更能将获得性免疫缺陷综合征（AIDS）和死亡的风险关联起来[10]。本研究发现，HIV-1未治疗PBMCs 中CD8+T细胞CD38和HLA-DR的表达明显高于治疗组和健康组，治疗组PBMCs中CD8+T细胞HLA-DR的表达高于健康组。CD8+T 细胞免疫激活后CD38和HLA-DR 显著升高，而CD8+T 细胞CD38 高表达是HIV 感染者疾病进展的标志之一[11-12]。在HIV-1感染过程中CD4+T 细胞计数值越低其PBMCs 中CD8+T 细胞CD38、HLA-DR 的表达越高，ART 治疗后CD38 和HLA-DR 的表达降低仍高于健康组，表明ART 治疗对HIV-1 病毒复制有一定抑制作用。但CD8+T细胞CD38和HLA-DR的过表达会逐渐影响机体免疫调节水平，如免疫系统不能及时下调异常的活化，其结果可能会引起自身免疫病的发生。随着病程的进展，表达在CD8+T细胞表面的负性刺激分子表达升高，这些分子的持续高表达会造成CD8+T细胞功能上的缺失，这个过程称为耗竭[13]。

PD-1是免疫球蛋白超家族成员之一，表达在活化的T、B 淋巴细胞和巨噬细胞表面。PD-1 作为重要的免疫检查点，在其效应细胞过度活化时起到抑制作用，通过对免疫系统的负调节来抑制免疫细胞的激活。在免疫调节中PD-1作为靶点在病毒感染、自身免疫疾病等方面具有重要的意义。本研究发现，未治疗的HIV-1感染者外周血CD8+T细胞PD-1的表达高于治疗组和健康组，低CD4+T细胞计数组PD-1表达高于高CD4+T细胞计数组，治疗组高于健康组。有研究表明，通过靶向PD-1通路增强细胞免疫对于HIV-1 治愈研究具有重要意义，CD8+T 细胞在初次感染后早期和在抗逆转录病毒抑制治疗下控制HIV-1复制至关重要[14]。在抗逆转录病毒治疗期间，PD-1 阻断可降低病毒的复制能力和水平[15]。还有相关研究发现，PD-1在HIV-1特异性CD4+T细胞中上调，并与CD4细胞计数呈负相关关系[16]。而本研究相关性分析表明，在CD8+T细胞中PD-1的表达与CD4 细胞计数也呈负相关关系，提示PD-1 的高表达与疾病进展相关，可被用作评估HIV-1 感染严重程度的指标之一。

同时，CD8+T 细胞是一系列具有不同功能的细胞群，为了进一步探究分子间活化耗竭的相关性，本组检测了CD38+HLA-DR+CD8+T 细胞PD-1 的表达水平。CD38 作为早期CD8+T 细胞活化的标志，而HLA-DR 作为晚期CD8+T 细胞活化的标志[17]，CD38+HLA-DR+是一群CD8+T细胞上高度活化的细胞，反映HIV-1病毒感染过程中免疫细胞的激活，提示免疫细胞处于高度活跃状态，同时增强免疫细胞杀伤HIV-1 病毒的能力[18]。通过实验分析CD38+HLA-DR+CD8+T 细胞PD-1 的表达可以进一步探讨CD8+T 细胞活化和耗竭之间的关系。本研究发现，未治疗组PBMCs中CD38+HLA-DR+CD8+T细胞PD-1 的表达均高于治疗组和健康组，表明低CD4+T 计数组PD-1的表达更高，且治疗组高于健康组。提示在慢性HIV-1 感染过程中,CD8+T 细胞的持续活化会诱导PD-1的表达升高，适时下调因免疫紊乱而过度活化的CD8+T细胞，避免机体造成持续感染或机会感染的风险。在HIV-2 型病毒感染组中，CD4+T细胞CD38、HLA-DR 和PD-1 的共表达频率升高[19]。通过检测CD38、HLA-DR 和PD-1 的共表达水平发现，HIV-1感染组CD4+和CD8+T细胞活化和耗竭的平均百分比要高于健康对照组[20]。上述结果与本研究结果相一致。由于PD-1 有抑制T 细胞功能激活的作用故而在疾病早期，病毒通过其对免疫细胞功能的抑制作用使得CD8+T 细胞杀伤病毒的能力减弱，病毒逃逸且持续感染。随着病情的进一步加剧，在HIV-1的中晚期抑制性分子PD-1的表达升高可能是由于中晚期免疫细胞严重受损以及CD4+T 细胞恢复不足，CD8+T 细胞杀伤能力减弱有关。相关性分析表明，未治疗HIV-1 感染者CD38+HLA-DR+CD8+T 细胞PD-1 的表达与CD4 计数呈负相关关系（P＜0.05）。由此可以说明，CD38+HLADR+CD8+T细胞PD-1的表达和病程有关且随着病程的进展而加剧。

综上所述，慢性HIV-1感染过程中CD38、HLADR 和PD-1 的表达均显著增高。其中PD-1 的表达对CD8+T 细胞以及其免疫功能有着重要的影响，CD8+T 细胞的耗竭与活化诱导的细胞凋亡有关。PD-1的高表达可能预示着疾病进程的加剧，可以作为评估HIV-1 感染严重程度的指标，有助于早期感染的控制，同时逆转抑制性受体的过度表达或许会成为一个治疗HIV-1感染的有效靶点。后续我们将选取其他分子表型或研究不同信号通路之间的关系进一步探究CD8+T 细胞上各分子间活化耗竭的关系。