五味子复合提取物对高脂血症大鼠的血脂调节作用及其机制

王春梅，田 雨，林程程，庄文越，李 贺，孙靖辉，陈建光，杨 波

(1.北华大学药学院，吉林 吉林 132013；2.北华大学医学技术学院，吉林 吉林 132013)

高脂血症是心脑血管疾病的基础，发病率高，危害大[1].由于患者在患病初期没有明显症状，其危害往往容易被忽视，高脂血症也被称为“沉默的杀手”和“多种疾病的源头”[2].中医倡导“预防为主”“防治一体”的理念，以维护人类健康，因此，早期干预对预防高脂血症引起的心脑血管疾病具有重要意义.除了控制饮食、定期锻炼和其他生活方式调整外，适当应用中药调节对于防治高脂血症来说也是不错的选择[3].

中医学认为高脂血症属于本虚标实之症，本虚表现为肝脾肾亏虚，标实表现为气滞、痰湿停聚、血瘀.因此，高脂血症的治疗原则在于调节脾肾功能，使水湿在体内的运转恢复正常，从根本上消除痰浊来源，同时，对于体内已形成之痰浊，应辅以利水化湿之法，达到标本兼顾的目的.所以，我们依据中医药理论，将五味子、葛根、黄芪和山楂组方，研究其调血脂作用.其中，五味子滋肾敛阴为君药，以助肾之开合；黄芪补气健脾为臣药，以行脾之健运；山楂消积散瘀为佐药，以助胃之开合；葛根升阳退热为使药，以消中焦热邪.现代药理学研究[4-7]表明：五味子、葛根、黄芪和山楂均具有显著的调节血脂作用.因此，本研究中将五味子、葛根、黄芪和山楂进行科学配伍，制备五味子复合提取物(Schisandra compound extract，SCE)，并探讨其对血脂的调节作用，通过检测大鼠肝组织中胆固醇代谢相关蛋白的表达量来进一步探讨其作用机制，从而为进一步开发具有脂质调节功能的保健食品提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器

选取体质量190～210 g的32只雄性Wistar大鼠(长春亿斯实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(吉)2018-0003)，在正常光照条件下，大鼠分笼饲养，室温(20±2)℃，相对湿度50%～60%.所有程序均经北华大学实验动物伦理委员会审查，批准编号20180912. 动物饲料(长春亿斯实验动物技术有限公司)中维持饲料组成：玉米粉72.7%，酪蛋白23%，维生素1%，矿物质3.1%，胱氨酸0.2%；高脂饲料组成：玉米粉53.3%，酪蛋白20%，猪油15%，蔗糖5%，维生素1%，矿物质3.5%，胱氨酸0.2%，胆固醇2%.五味子、葛根、黄芪、山楂(河北省安国药材市场)由北华大学药学院王维教授根据《中华人民共和国药典》(2015版)的鉴定标准进行鉴定.

低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、胆固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；GAPDH、PPARα、LXRα、CYP7A1、SREBP2、HMGCR和HRP-羊抗兔IgG抗体(武汉ABclonal有限公司)；HiScript®Ⅱ One Step RT-PCR Kit试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)；总RNA提取试剂盒(北京百泰克生物制品有限公司)；Infinite M200酶标仪(Tecan集团公司，瑞士)；PowerPac型Western blot电泳仪和转膜仪(Bio-Rad公司，美国)；PS普诺森FluorChem M成像系统(ProteinSimple公司，美国)；Mastercycler gradient 5331型PCR仪(Eppendorf公司，美国).

1.2 五味子复合提取物的制备

称取五味子、葛根、黄芪和山楂(10 g∶25 g∶50 g∶20 g)，研磨成粉末，置于圆底烧瓶中，加入45倍体积的蒸馏水，95 ℃加热回流提取3次，每次3 h，将提取液进行过滤，合并3次滤液.再将滤液浓缩得到棕色浸膏，产率为34.2%.通过苯酚-硫酸法测定SCE中多糖含量[8]，通过高效液相色谱法测定SCE中葛根素含量，经计算，SCE中每100 g含9.85 g多糖，含0.45 g葛根素.

1.3 高脂血症大鼠模型的制备、分组及给药方式

将32只Wistar雄性大鼠随机分为4组，空白对照组(Control)、高脂模型组(Model)、低剂量SCE组(100 mg/kg)和高剂量SCE组(200 mg/kg)，每组8只.除空白对照组外，其余3组大鼠均采用高脂饲料喂养诱导高脂血症大鼠模型，SCE低、高剂量组均在给予高脂饲料时即开始灌胃干预，每组大鼠给药量均为5 mL/kg，空白对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，1次/d，持续8周.检测大鼠血脂水平，以TG、TC、LDL-C水平明显升高作为造模成功的标准[9-10]，同时每周检测大鼠体质量.

1.4 样本采集

最后一次给药12 h后，乙醚麻醉大鼠，进行腹主动脉取血，4 ℃分离血清(3 500 r/min，10 min)，-20 ℃保存待用.采血后快速取出大鼠肝脏，用4 ℃预冷的生理盐水洗涤，滤纸吸干后称取肝质量，并计算肝指数：肝指数=肝质量(g)/体质量(g)×100%.其中一部分保存在-80 ℃冰箱中，另一部分用于组织病理学检查.

1.5 各组大鼠血清生化指标检测

采用酶学方法检测大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，具体操作严格参照试剂盒说明书进行.

1.6 各组大鼠肝组织中TC、TG含量检测

取100 mg肝组织溶于试剂盒的裂解液中，制成10%肝匀浆，具体操作步骤参照TC、TG水平检测试剂盒说明书.

1.7 各组大鼠组织病理学观察

将肝组织标本置入10%中性福尔马林溶液中固定后，流水冲洗，经过梯度酒精洗脱，浸蜡包埋，制成5 μm石蜡切片，用苏木精-伊红进行染色，显微镜下观察大鼠肝细胞病理形态(放大倍数，×200和×400).

1.8 RT-PCR法检测大鼠肝组织中PPARα、LXRα、CYP7A1 HMGCR和SREBP2 mRNA的表达

采用高纯总RNA快速提取方法，提取各组大鼠肝脏组织总RNA.按照HiScript®Ⅱ One Step RT-PCR Kit试剂盒对每个样品的RNA进行反转录和扩增反应.扩增条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，退火30 s(退火温度：PPARα、CYP7A1和 GAPDH为55 ℃，HMGCR和SREBP2为58 ℃，LXRα为56 ℃)，72 ℃延伸30 s，共30个循环；72 ℃延伸5 min后4 ℃下保存.

引物序列：PPARα上游引物5′-GGACTCGA GGAGGTCAAGAA-3′，下游引物5′-GGGAGTGGTC ATCCATCACA-3′；LXRα上游引物5′- GAGTCATC CGAGCCTACAGC-3′，下游引物5′-AAGAATCCCTT GCAGCCCTC-3′；CYP7A1上游引物5′-TTTGGGG AATTGCCGTGTTG-3′，下游引物5′-ACGGAATCAA CCCGTTCTCC-3′；SREBP2上游引物5′-CCGAACTG GGCGATGGATG-3′，下游引物5′-CTGGCTGAAT GACCGCTGTA-3′；HMGCR上游引物5′-GCGGCA GCTTGAGATCAT-3′，下游引物5′-AGCTCAGC CATTTTGCCAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGCAAG TTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCCAGTAGA CTCCACGACAT-3′.取PCR产物(10 μL)进行1%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶图像系统所得到的目标条带进行灰度值分析，计算各组基因与内参GAPDH的相对表达值.

1.9 Western blotting检测大鼠肝组织中PPARα、LXRα、CYP7A1、HMGCR和SREBP2蛋白表达

从-80 ℃冰箱中取出50 mg大鼠肝脏组织，加入450 μL组织蛋白裂解缓冲液，匀浆器匀浆后冰上裂解1 h.离心10 min(12 000 r/min，4 ℃)，收集上清，通过BCA法测定上清液中的组织蛋白浓度.将蛋白质样品沸水浴加热10 min使其变性，经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后转移到PVDF膜.于5%脱脂奶粉中摇床封闭2 h，分别加入PPARα(1∶1 500稀释)、LXRα(1∶1 500稀释)、CYP7A1(1∶1 000稀释)、SREBP2(1∶2 000稀释)和HMGCR(1∶2 000稀释)第一抗体，4 ℃孵育过夜.将膜用TBST洗涤3次，10 min/次，然后在室温下进行二抗(1∶5 000稀释)温育1 h.用ECL显影液进行显色曝光，并使用化学发光成像系统拍摄图像.蛋白质的相对表达量用目标蛋白/GAPDH表示.

1.10 统计学分析

2 结 果

2.1 各组大鼠体质量和肝指数

与空白对照组比较，模型组大鼠体质量明显升高(P<0.01)，肝指数明显增加(P<0.01)；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠体质量和肝指数明显降低(P<0.05).见表1.

表1 各组大鼠体质量和肝指数Tab.1 Body weight and liver index of rats in each group

2.2 各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平

与空白对照组比较，模型组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显升高(P<0.01)，HDL-C水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显降低(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平明显升高(P<0.05)；与低剂量五味子复合提取物组比较，高剂量五味子复合提取物组大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明显降低(P<0.05)，HDL-C水平明显升高(P<0.05).见表2.

表2 各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Tab.2 Serum TC，TG，LDL-C and HDL-C levels of rats in each group

2.3 各组大鼠肝组织中TC、TG含量检测

与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中TC和TG含量明显增加(P<0.01或P<0.05)；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝组织中TC和TG含量明显降低(P<0.01或P<0.05)；与低剂量五味子复合提取物组比较，高剂量五味子复合提取物组大鼠肝组织中TC含量明显降低(P<0.05).见表3.

表3 各组大鼠肝脏中TC、TG水平Tab.3 TC and TG levels in the liver of rats in each group

2.4 各组大鼠肝脏病理形态表现

空白对照组大鼠肝小叶结构规则，肝细胞条索状排列；模型组大鼠几乎所有肝细胞胞浆内可见空泡，肝血窦腔受压变窄，肝组织损伤严重；低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝细胞胞浆内空泡数量减少，肝血窦清晰可见，大鼠肝脏病变得到明显缓解.见图1.

2.5 各组大鼠肝脏组织中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中PPARα、LXRα和CYP7A1的表达水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝脏组织中PPARα、LXRα、CYP7A1的表达水平均明显增加(P<0.05或P<0.01).与低剂量五味子复合提取物组比较，高剂量五味子复合提取物组大鼠肝脏组织中PPARα mRNA表达明显增加(P<0.05).见图2、表4.

A.Control group；B.Model group；C.low dose of SCE group；D.high dose of SCE group；第1行为HE，×200，第2行为HE，×400.图1 各组大鼠肝脏病理形态表现Fig.1Pathological morphology of rat liver in each group

1.Control group；2.Model group；3.low dose of SCE group；4.high dose of SCE group；A.mRNA expression electropherogram；B.Proteins expression electropherogram.图2 RT-PCR法和Western blotting 法检测各组大鼠肝脏组织中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白表达电泳Fig.2Electrophoresis of protein expression of PPARα，LXRα and CYP7A1 mRNA in liver of rats in each group detected by RT-PCR method and Western blotting method

表4 各组大鼠肝脏组织PPARα、LXRα 、CYP7A1的mRNA和蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of PPARα，LXRα and CYP7A1 mRNA and proteins in liver tissue of rats in each group

2.6 各组大鼠肝脏组织中 SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表达水平

与空白对照组比较，模型组大鼠肝脏组织中SREBP2和HMGCR的表达水平明显增加(P<0.01)；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝脏组织中SREBP2、HMGCR的表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)；与低剂量五味子复合提取物组比较，高剂量五味子复合提取物组大鼠肝脏组织中SREBP2、HMGCR mRNA表达水平明显降低(P<0.05).见图3、表5.

1.Control group；2.Model group；3.low dose of SCE group；4.high dose of SCE group；A.mRNA expression electropherogram； B.Proteins expression electropherogram.图3 RT-PCR法和Western blotting 法检测各组大鼠肝脏组织中SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表达电泳Fig.3Electrophoresis of protein expression of SREBP2 and HMGCR mRNA in liver of rats in each group detected by RT-PCR method and Western blotting method

表5 各组大鼠肝脏组织中SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表达水平Tab.5 Protein expression levels of SREBP2 and HMGCR mRNA in liver tissue of rats in each group

3 讨 论

高脂血症是体内脂质紊乱导致血脂水平增高的代谢性疾病.随着生活水平的提高，人们饮食结构和生活习惯发生改变，富含脂类和蛋白类的高脂肪高热量食物已经取代了原本的粗纤维食物，同时由于体力劳动和运动的时间、强度逐渐减少，导致肥胖者居多，血脂普遍偏高.现代药理学研究[11-12]表明：五味子多糖可以显著减轻非酒精性脂肪性肝病和高脂饮食诱导的2型糖尿病动物模型中的脂质代谢紊乱.黄芪多糖可以改善小鼠的高脂血症，其作用与辛伐他汀相似[13]，葛根素主要存在于豆科植物野葛根部，具有生津止渴、降血压的功效.通过增加高胆固醇血症大鼠肝脏中CYP7A1的表达来降低胆固醇含量，对高血糖和高脂血症有明显的预防作用[14].本研究结果显示：高脂饮食喂养8周可导致大鼠发生脂代谢紊乱，血脂水平升高，经不同剂量五味子复合提取物治疗后，大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明显降低，肝脏脂质沉积减轻.

肝脏是维持胆固醇稳态的重要器官，胆固醇的水平受许多因素的影响，例如吸收、合成、排泄和分解.HMGCR是肝脏中胆固醇合成的限速酶，其活性大小直接影响着胆固醇合成的速度，影响着体内胆固醇的含量[15].SREBP2是调节脂质合成和代谢的关键核转录因子，当细胞内胆固醇降低时，SREBP2促进HMGCR的表达，从而增加胆固醇的生物合成[16-18].有研究[19]表明，高胆固醇饮食的大鼠体内HMGCR和SREBP2的表达增加，而在给予药物治疗后其表达被抑制，与上述报道一致.本研究结果显示：模型组大鼠肝组织中SREBP2和HMGCR的表达水平明显高于空白对照组；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝组织中SREBP2和HMGCR的表达水平明显下降，表明五味子复合提取物可通过降低SREBP2的表达来调节HMGCR的转录，从而抑制胆固醇的合成，降低高脂血症大鼠体内胆固醇水平.

胆固醇在肝脏中转化为胆汁酸是降低血清胆固醇水平、维持机体胆固醇平衡的另一条重要途径之一，而CYP7A1是胆固醇转化为胆汁酸的关键酶[20].有研究[21-22]表明：通过增加CYP7A1的表达，能够促进胆固醇和胆汁酸的排泄，进而降低胆固醇水平.CYP7A1的活性受肝X受体-α(LXRα)的调控，在整体水平上直接作用于小鼠LXR的配体，激活LXRα，CYP7A1基因的表达也明显增强[23].过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPARα)作为配体活化的转录因子，可与靶基因上的LXR调节元件(PPRE)结合，进而上调LXR基因的转录，增加CYP7A1的活性[24].有研究[25-27]显示：高脂饮食诱导的高脂血症大鼠及小鼠模型肝组织中PPARα、LXRα和CYP7A1的表达均显著降低.本研究结果显示：模型组大鼠肝组织PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白的表达水平均低于空白对照组；与模型组比较，低、高剂量五味子复合提取物组大鼠肝组织中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白的表达水平增加，表明五味子复合提取物可通过激活PPARα上调LXRα来促进CYP7A1的表达，进而增加胆汁酸的生成，降低体内胆固醇的水平.

综上所述，五味子复合提取物可有效降低高脂血症大鼠体质量，调节血脂水平，减轻肝脏脂质沉积，并可能通过调节PPARα/LXRα/CYP7A1和HMGCR/SREBP2信号通路的表达促进胆固醇的排泄，抑制胆固醇的合成，进而达到改善高脂血症的目的.