不同品种大蒜提取物对层出镰孢菌的抑菌作用分析

陈存，潘志佳，邓艳，曾其国，刘应平,任迎虹*

(1.成都师范学院 化学与生命科学学院 特色园艺生物资源开发与利用四川省高校重点实验室，成都 611130；2.成都师范学院 史地与旅游学院，成都 611130；3.四川省地质调查院 稀有稀土战略资源评价与利用四川省重点实验室，成都 610081)

镰孢菌属(Fusarium)真菌能造成蔬菜枯萎病[1]，会造成蔬菜大量减产，严重时甚至会造成绝收，对我国农业和食品业造成了巨大的经济损失[2]。层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)是瘤座孢科镰刀菌属的重要植物病原真菌，可侵染水稻、小麦、玉米、芦笋等作物，引起枯萎病、腐烂病等[3]。目前关于防治层出镰孢菌引起的植物病害的主要手段为化学农药抑制剂[4-5]，不仅对生态环境造成了破坏性的影响，还导致一些植物病原菌产生了耐药性。生物农药具有无毒害、不易产生抗药性、对环境友好的优点，更重要的是对人体没有毒害作用，符合人们对健康的追求[6-7]。大蒜(Alliumsativum)是葱属多年生草本植物，作为必不可少的调味品，其具有极大的药用价值[8-9]，国内外较多研究大蒜抑菌作用的报道[10-12]，但对不同品种间大蒜抑菌活性比较的研究鲜有报道，了解大蒜提取物对层出镰孢菌的抑菌作用并初步探究其抑菌机理，能为进一步开发新型环保生物源抑制剂提供指导性建议。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试大蒜：购自四川省成都市温江区游家渡菜市场；供试菌株：层出镰孢菌(Fusariumproliferatum)，北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 实验试剂

碱性磷酸酶测试盒、蛋白含量(BCA)测试盒：南京建成生物工程研究所；马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、马铃薯葡萄糖培养基(PDB)：上海博微生物科技有限公司；提取液：Tris(Phygene)，配制成pH 3.0的Tris-HCl溶液。

1.3 实验仪器与设备

LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；SC-3610低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；PHB-1笔型酸度计 上海世诺物理光学仪器有限公司；雷磁DDS-037型电导率仪 上海精密科学仪器有限公司；UV5100紫外可见分光光度计 安徽皖仪科技股份有限公司；KYC-100C空气恒温摇床 上海新苗医疗器械制造有限公司；SW-CJ2D双人单面超净台 苏州智净净化设备有限公司；JEM-1230 型透射电镜 JEOL日本电子公司。

1.4 实验方法

1.4.1 4种大蒜粗提物的制备[13]

将新鲜大蒜去皮后用研钵磨成糊状，称取5 g 4种不同大蒜分别与10 mL Tris-HCl(pH 3.0)溶液混合做好区分标记(a，b，c，d)，常温静置2 h初提[14]，用滤纸过滤后将滤液以10000 r/min冷冻离心20 min，取上清液过0.22 μm无菌滤膜，将得到的大蒜提取液装入EP管中，做好标记，放入4 ℃冰箱中保存待用。

1.4.2 菌种活化和菌丝体的培养

在无菌条件下，用接种环蘸取菌悬液划线接种于PDA斜面上，放入28 ℃恒温培养箱中培养2 d，待其长出菌丝体转入4 ℃冰箱中备用。用无菌接种环刮取斜面上的菌丝体，并用无菌水冲洗制备层出镰孢菌菌悬液，移取1 mL菌悬液于灭好菌的EP管中，用透气膜封口，以8000 r/min冷冻离心5 min，弃上清(保留少许上清液)，放入4 ℃冰箱中备用。

1.4.3 抑菌圈的测定

采用牛津杯法[15]测定样品的抑菌圈。在超净工作台中，取上述100 μL菌悬液在平板上均匀涂布，用镊子在每个平板中放入5个牛津杯，分别加入20 μL 4种不同品种大蒜提取液，用 20 μL pH 3.0的Tris-HCl溶液作为对照，放入28 ℃恒温培养箱中培养2 d。

1.4.4 相对电导率的测定

将收集到的菌丝体在PDB培养液中培养 2 d 后，每10 mL培养液中加入0.5 mL大蒜提取液，经120 r/min，28 ℃振荡培养，采用电导仪测定相对电导率，分别于 0，1，2，4，6，8，12 h 时以无菌水为对照测定电导率，每个样品重复 3 次。

1.4.5 蛋白浓度的测定

采用蛋白定量(BCA)测试盒对菌液总蛋白浓度进行测定。上述加入大蒜提取液的培养液分别于0，4，8，12，16 h时收集培养液，以4000 r/min进行离心，取上清液备用，每个样品重复3次，按表1中比例稀释样液。

表1 总蛋白含量测定操作表Table 1 The determination of total protein content

旋涡混匀，静置5 min，526 nm波长，水调零OD值。采用下列公式对总蛋白浓度进行计算：

式中：A1为测定管吸光度；A2为标准管吸光度；A0为空白管吸光度；ρ为标准液浓度，563 μg/mL；D为样本测定前稀释倍数。

1.4.6 碱性磷酸酶(AKP)酶活性的测定

采用碱性磷酸酶测试盒对菌液AKP酶进行测定。上述加入大蒜提取液的培养液分别于0，4，8，10，12，14，16 h时收集培养液，每个样品重复3次，再按照表2进行操作。

表2 AKP酶活性测定操作表Table 2 The determination of AKP enzyme activity

根据下列公式进行计算：

式中：A1为测定管吸光度；A2为标准管吸光度；m为标准管含酚的量，0.005 mg。

式中：A1为测定管吸光度；A2为标准管吸光度；V1为取样量，0.03 mL；ρ为待测样本蛋白浓度，mgprot/mL；m为标准管含酚的量，0.003 mg。

1.4.7 透射电镜观察

将层出镰孢菌接种于加入“红七星”提取物浓度为5×10-3g/mL的PDA培养基中，对照用无菌水，培养48 h后在菌落边缘取样用于透射电镜下观察。

样品的固定:采用戊二醛、锇酸双重固定法。取材灌注固定：快速取材，切取1 mm×1 mm菌块，用生理盐水清洗菌块，在 4 ℃用2.5%戊二醛进行前固定 2 h以上；用磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.2)冲洗 4～6次；再用1%锇酸后固定 2.5 h；0.1 mol/L，pH 7.2 的磷酸缓冲液冲洗 4～6次；1%醋酸铀块染 2 h；乙醇梯度(30%、50%、70%、90%、95%、100%，3次)脱水；环氧丙烷代换 2 次；环氧丙烷∶epon树脂为2∶1 渗透2 h，环氧丙烷∶epon 树脂为1∶2 渗透 2 h，纯树脂渗透过夜；进行包埋，37 ℃聚合12 h，45 ℃聚合12 h，60 ℃聚合48 h；最后半薄切片光镜定位，于JEM-1230型透射电镜下观察并拍照。

1.4.8 不同品种大蒜气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析

将不同品种大蒜提取液通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进行分析，分析条件：TG-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，载气为氦气，电离电压：70 eV，流速1 mL/min，柱温：60 ℃维持5 min，再以10 ℃/min的速度升至220 ℃。分析得到的数据用MS数据库NIST05.LIB和NIST05s.LIB进行光谱分析和化合物鉴定。

2 结果与分析

2.1 4种不同大蒜的抑菌性

以抑菌圈的大小研究4种不同品种大蒜提取液的抑菌活性，抑菌圈的直径越大，抑菌活性越大。抑菌效果见图1。

图1 4种粗提液在接种培养基上形成的抑菌圈Fig.1 The inhibition zone formed by four kinds of extracts on inoculation medium注：a为二水早；b为独蒜；c为红七星；d为太仓白皮；e为对照。

由图1可知，“红七星”的提取液对层出镰孢菌的抑菌效果最明显，达到20 mm以上，其次是“二水早”，抑菌圈直径达16 mm，“独蒜”为10 mm，“太仓白皮”为8 mm，“独蒜”和“太仓白皮”的抑菌效果不如“红七星”和“二水早”明显。

2.2 相对电导率

4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌相对电导率的影响结果见图2。

图2 4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌相对电导率的影响Fig.2 Effect of four kinds of garlic extracts on the relative conductivity of Fusarium proliferatum注：C为对照；T为太仓白皮；S为独蒜；E为二水早；H为红七星。

由图2可知，当层出镰孢菌菌液中未加入大蒜提取物时(C对照)，菌液的电导率由培养1 h时的0.06%增加到培养12 h后的2.15%，增加幅度很小。而当分别加入4种不同大蒜提取物时，12 h后菌液的电导率分别增加至4.69%、5.89%、16.00%、20.02%，其中“红七星”的相对电导率变化最大。相对电导率是衡量细胞膜通透性的重要指标，其值越大，表示电解质的渗漏量越大，细胞膜的完整性受到的破坏程度也就越大[16]。当它受到破坏时，细胞内的钾离子、质子等电解质大量外泄，致使细菌细胞死亡。实验结果显示：经过“红七星”和“二水早”提取物处理后的菌液的相对电导率较高，说明“红七星”和“二水早”的抑菌效果较佳。

2.3 蛋白浓度

4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌总蛋白浓度的影响结果见图3。

图3 4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌总蛋白浓度的影响Fig.3 Effect of four kinds of garlic extracts on the total protein content of Fusarium proliferatum注：C为对照；T为太仓白皮；S为独蒜；E为二水早；H为红七星。

由图3可知，未加入大蒜提取物的菌液培养12 h后相对于培养4 h时蛋白含量增加了16.78 μg/mL，而当分别加入4种大蒜提取物培养12 h后，相对于培养4 h时分别增加了42.11，53.67，135.06，143.72 μg/mL。相比于对照组和其他两种大蒜提取物对菌体总蛋白浓度的影响可以得出，“红七星”和“二水早”导致菌体蛋白泄露最多。管敏等[17]在研究对金黄色葡萄球菌的抗菌机理时发现，菌悬液中总蛋白浓度越高，表明金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜的完整性受到的破坏程度越大。通过对细胞膜系统的破坏，细胞膜的通透性增强，细胞内含物(主要是蛋白质)大量外泄，导致菌液中蛋白含量较高，说明“红七星”和“二水早”对细胞的破坏程度最大，其抑菌效果也最佳。

2.4 碱性磷酸酶(AKP)活性

4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌AKP酶活性的影响结果见图4。

图4 4种不同大蒜提取物对层出镰孢菌AKP酶活性的影响Fig.4 Effect of four kinds of garlic extracts on AKP enzyme activity of Fusarium proliferatum注：C为对照；T为太仓白皮；S为独蒜；E为二水早；H为红七星。

由图4可知，未加入大蒜提取物时，菌液中AKP酶活性很小，变化也不大。但当加入4种不同大蒜提取物后，培养了12 h 时AKP酶活性相对于培养4 h时分别增加了27.74，40.29，154.70，201.09金氏单位/100 mL，其中加入“红七星”和“二水早”的菌液中AKP酶活性很高。AKP酶[18]是衡量细胞膜完整性的重要指标之一，主要参与细菌的应激反应，当细菌处于一个对其有害的环境时，AKP酶的活性会增强。菌悬液中AKP酶的活性越高，说明菌体细胞受到的破坏越大，由此得出，“红七星”和“二水早”的抑菌效果最佳。

2.5 镰孢菌细胞形态的变化

“红七星”提取物处理前后细胞的形态变化结果见图5。

图5 “红七星”提取物处理前后细胞的形态变化Fig.5 The morphological changes of cells before and after treatment with "Hongqixing" extracts注：A为未加红七星提取物时的细胞形态；B为加入红七星提取物后的细胞形态。

图5中A表示当层出镰孢菌菌液中未加入大蒜提取物时细胞呈完整的圆形，当加入了抑菌活性最佳的“红七星”大蒜提取物后菌体的细胞形态发生了显著变化，细胞形态变得不规则(见图5中B)，主要是由于其细胞壁遭到了破坏，使得维持细胞形态的功能丧失，“红七星”大蒜良好的抑菌作用就是通过破坏其细胞结构，使细胞不能进行正常的生命活动而死亡。

2.6 不同品种大蒜的GC-MS分析图谱

4种不同大蒜提取物GC-MS图谱分析结果见图6。

图6 4种不同大蒜提取物GC-MS图谱分析Fig.6 GC-MS chromatogram analysis of four kinds garlic extracts注：a为太仓白皮；b为红七星；c为二水早；d为独蒜；1为乙酸，2为2-氨基-5-甲基苯甲酸，3为3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-4-烯，4为3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-5-烯，5为 5-羟甲基糠醛，6为二烯丙基三硫化物(DATS)，7为β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷。

在GC-MS检测到的多种挥发性化合物中，含量较高的包括酸类化合物、杂环类化合物、醛类化合物、含硫化合物等，其中含硫化合物以3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-4-烯、3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-5-烯、二烯丙基三硫化物为主。“红七星”提取液中挥发性物质主要成分为5-羟甲基糠醛、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷、3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-5-烯；“二水早”提取液中挥发性物质主要成分为5-羟甲基糠醛、2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷；“太仓白皮”中挥发性物质主要成分为乙酸、2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷；“独蒜”中挥发性物质主要成分为2-氨基-5-甲基苯甲酸、β-D-呋喃果糖基α-D-吡喃葡萄糖苷。这些大蒜粗提物中的硫化物以二硫化物和三硫化物为主，二硫化物以3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-4-烯、3-乙烯基-1,2-二硫杂环己-5-烯为主，三硫化物以二烯丙基三硫化物为主。此外，在大蒜“红七星”和“二水早”提取液中均大量存在的5-羟甲基糠醛，在“太仓白皮”和“独蒜”提取液中并不存在或有非常少量的存在，同时，“红七星”和“二水早”的硫化物含量和抑菌活性也高于其他两种大蒜。有研究显示，大蒜提取物中的抑菌活性成分非常复杂，是由多种成分共同作用的，其中包括易挥发和易分解的化合物，也包括稳定和不易挥发的化合物，其中易挥发含硫化合物是主要的抑菌活性成分[19]。

3 结论

通过透射电镜图发现，经大蒜提取物处理过的层出镰孢菌细胞形态变化显著，由此可得，大蒜对菌体的抑制作用主要表现在破坏其细胞壁及细胞膜的完整性。通过测定大蒜处理后的菌液中相对电导率、总蛋白浓度和碱性磷酸酶的浓度变化，发现经过处理后的菌液3项指标均递增的变化趋势与大蒜抑菌圈的大小呈正相关，并综合得出抑菌效果最佳的大蒜品种。通过GC-MS分析图谱明确了4种不同品种大蒜中挥发性物质的种类和其含量各不相同，其中易挥发含硫化合物是其主要的抑菌活性成分，含硫化合物主要以二硫化合物和三硫化合物为主，其中二烯丙基三硫化物的抑菌效果最佳，但抑菌效果较好的“红七星”和“二水早”中含量较高的5-羟甲基糠醛也值得关注。目前较多研究均是以粗提物或混合物为对象，有关大蒜提取物中到底是哪一种或哪几种物质在起作用并没有详细报道。本课题为今后不同品种大蒜提取物中具体活性成分的研究提供了基础条件，同时为新型生物农药的研发提供了一定的理论依据。