高浓度蔗糖乙醇分批发酵动力学研究

刘明，伍时华，龙秀锋*，易弋，曾令杰

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西科技大学广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006)

甘蔗是一种廉价高产的作物，在广西有着得天独厚的优势[1]。它的主要成分是水、蔗糖、无机物等，它又是制取白砂糖的主要原料[2]，其副产物甘蔗糖蜜主要用于生产酒精。蔗糖乙醇发酵的实质是蔗糖先被酵母分泌的蔗糖水解酶在胞外水解为果糖和葡萄糖，然后果糖和葡萄糖在酵母细胞内经EMP途径生成丙酮酸，进而生成乙醇，后续加工提纯为工业酒精或燃料乙醇[3-4]。目前对甘蔗汁和甘蔗糖蜜酒精发酵的研究多集中于甘蔗糖蜜预处理、发酵菌种筛选、工艺优化等方面[5-9]，但是很少有对蔗糖乙醇发酵过程酵母生长、乙醇生成、基质消耗动力学规律方面的研究。

发酵动力学是研究菌体生长、底物消耗、产物生成之间的动态定量关系[10-11]，建立相应动力学方程的数学模型，从而达到认识发酵过程规律，优化发酵工艺、提高发酵产量、预先估计含量变化的目的，为补料发酵、放大实验提供了理论基础[12-13]。模拟发酵过程的模型有很多种[14-17]，大多数人采用的是非结构模型或经验模型，Zakeri等[18]利用非结构模型建立动力学方程可以成功预测甘蔗糖蜜生产黄原胶的发酵过程，为黄原胶的工业化生产奠定了一定的理论基础。为了能够利用简单数学模型表示复杂的发酵过程曲线，本文重点研究高浓度(260 g/L)蔗糖乙醇分批发酵过程中酵母生长、乙醇生成、总糖消耗情况，利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程拟合实际发酵过程中的数据，并对模型拟合情况进行分析，找到能预测发酵过程的动力学方程，对甘蔗糖蜜和甘蔗汁高浓度乙醇扩大生产有一定的参考意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

酿酒酵母GJ2008(Saccharomycescerevisiae)：由广西科技大学发酵工程研究所保藏，适用于高浓度蔗糖乙醇发酵。

1.1.2 培养基(g/L)

一级种子培养基：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，自然pH(50 mL三角瓶装液量30 mL)；二级种子培养基：葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(500 mL三角瓶装液量300 mL)；蔗糖发酵培养基：蔗糖260，酵母粉10，蛋白胨20，pH自然(5 L发酵罐装液量3 L)。以上培养基均使用高压蒸汽在115 ℃灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂及仪器

蔗糖：市售，生产于广西；硫酸(AR)：西陇科学股份有限公司；葡萄糖、果糖(AR)：天津科密欧化学试剂有限公司；乙腈、乙醇(AR)：安徽时联特种溶剂股份有限公司；酵母粉、蛋白胨(BR)：广东环凯微生物科技公司。

SQP电子天平 赛多利斯科学仪器有限公司；Chormaster高效液相色谱仪、Himic大容量冷冻离心机 日本Hitachi公司；Biotech-5BG×5-94005L发酵罐 上海保兴生物设备公司；LDZH-100KBS立式压力灭菌器 上海申安医疗器械厂；BX43生物显微镜 奥林巴斯有限公司；ZWYR-C2402触控摇床 上海智诚分析仪器制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 种子培养方法

取1环斜面菌体至一级种子培养基，在摇床32 ℃、150 r/min条件下培养12 h后离心去上清液，加无菌水制成10倍浓缩一级种子菌悬液。将10倍浓缩一级种子菌悬液3 mL接至二级种子培养基，在摇床32 ℃、150 r/min条件下培养8 h后离心去上清液，加无菌水制成10倍浓缩二级种子菌悬液。

1.2.2 发酵方法

将30 mL 10倍浓缩二级种子菌悬液接至5 L发酵罐发酵培养基，在转速150 r/min、温度32 ℃、通气量80 mL/min条件下，进行微通氧发酵；从0 h开始，每隔3 h取一次发酵液进行测定，设置2组平行，结果取平均值。

1.3 检测分析方法

酵母细胞数的测定：取发酵液样品用蒸馏水稀释一定倍数，充分振荡并采用血球计数板在光学显微镜下计数。

液相色谱检测糖条件：色谱柱为Alltima Amino(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流动相为乙腈∶超纯水为80∶20(V/V)，流速为1 mL/min，进样量为20 μL。总糖=蔗糖×1.05+果糖+葡萄糖。

液相色谱检测乙醇条件：色谱柱为Lachorm C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温35 ℃，流动相为5 mmol/L硫酸溶液，流速为0.6 mL/min，进样量为20 μL。

1.4 发酵动力学模型求解

通过蔗糖发酵试验得到酵母生长、乙醇生成、总糖消耗随时间变化的曲线，以Logistic方程描述酵母生长及乙醇生成随时间变化的曲线，以Luedeking-Piret-like方程描述总糖消耗过程。利用Origin 9.5软件绘图并对这3项的检测数据进行非线性拟合，采用Levenberg-Marquardt算法和全局优化算法获得参数，并求出带有具体参数的动力学方程。

2 结果与分析

2.1 蔗糖乙醇分批发酵过程中酵母数、乙醇浓度和总糖含量的变化

按照1.2.2中的发酵方法对蔗糖进行乙醇发酵，并对发酵过程中的酵母数、乙醇浓度进行检测和对总糖含量进行计算，结果见图1。

图1 260 g/L蔗糖乙醇分批发酵过程Fig.1 The batch fermentation process of ethanol with 260 g/L sucrose

由图1可知，在接种二级浓缩菌悬液后，酵母菌的生长过程变化可分为两个阶段，0～15 h为快速生长期，酵母数呈线性增加，生长速率较快；15 h后进入稳定期，酵母数趋于平缓，酵母数最大达4.23×108个/mL。乙醇含量随着菌体生长而增加，说明产物生成与菌体生长属于“生长偶联型”，0～6 h乙醇增加得比较缓慢，6 h之后酵母细胞产生乙醇能力开始增加，乙醇浓度快速增加，在27 h时乙醇浓度趋于平缓，39 h发酵结束，终乙醇量为111.17 g/L。总糖消耗趋势与乙醇大致相同，0～6 h之间总糖消耗缓慢，期间减少的糖主要用于菌体生长，在6 h之后糖消耗加快，乙醇快速增加，二者有很大的相关性，33 h残总糖趋于平缓，发酵结束时残总糖为17.86 g/L。

2.2 发酵动力学模型的建立和求解

2.2.1 酵母生长动力学模型

Logistic方程是由比利时学者Verhulst提出的一种“S”形曲线，此方程在拟合分批发酵中酵母生长很实用，能较好反映发酵过程中酵母增加对自身生长的抑制作用[19]，方程如下：

(1)

式中：x为酵母浓度，×108个/mL；xm为最大酵母浓度，×108个/mL；μm为最大比生长速率，h-1；t为发酵时间，h。将式(1)积分：

将x∈(x0, xt)，t∈(0, t)对上式积分得：

(2)

利用软件将式(2)进行自定义拟合，代入图1数据后得到酵母生长动力学曲线，见图2，其相关参数及方差分析表见表1和表2。

图2 酵母生长试验值拟合曲线Fig.2 The fitting curve of yeast growth test values

表1 参数估计值(菌体生长)Table 1 The parameter estimates (cell growth)

表2 方差分析(菌体生长)Table 2 The analysis of variance (cell growth)

由图2可知，曲线在酵母快速生长期时拟合度较好，但是在平稳期时可能由于取样的原因导致测定值有高有低，拟合度没有快速生长期好。由表1和表2可知，酵母拟合曲线的均方根误差为0.134，相关系数R2为0.9915，F值为3135.719，说明拟合结果较好，此模型可以较好反映260 g/L蔗糖酒精发酵过程中酵母的生长变化。

2.2.2 乙醇生成动力学模型

乙醇生成模型同样属于“S”形曲线，本试验乙醇生成动力学模型仍采用Logistic方程进行预测模拟。

(3)

式中：p为乙醇质量浓度，g/L；pm为乙醇最大质量浓度，g/L；μn为最大比生成速率，h-1；t为发酵时间，h。将式(3)积分得：

将p∈(p0, pt)，t∈(0, t)对上面公式积分得：

(4)

利用软件将式(4)进行拟合，代入图1数据后得到乙醇生成动力学曲线，见图3，其相关参数及方差分析表见表3和表4。

图3 乙醇生成试验值拟合曲线Fig.3 The fitting curve of ethanol generation test values

表3 参数估计值(乙醇生成)Table 3 The parameter estimates (ethanol generation)

表4 方差分析(乙醇生成)Table 4 The analysis of variance (ethanol generation)

由图3可知，在6 h之前拟合效果不好，预测值始终高于测定值，甚至在95%置信区间之下，结合图2的酵母生长拟合曲线，说明在高浓度蔗糖乙醇分批发酵过程的前期主要是细胞生长，乙醇生成很少。但在9 h之后乙醇生成量开始快速增加并且在33 h趋于平缓，可知在酵母稳定期也有相当一部分乙醇生成。由表3和表4可知，乙醇生成拟合曲线的相关系数为0.9940，均方根误差为4.044，F值为1672.07，虽然9 h之前的乙醇生成量比预测值低，但是总体的拟合趋势良好，说明此方程能大致反映260 g/L蔗糖酒精发酵过程中乙醇的生成变化。

2.2.3 总糖消耗动力学模型

总糖消耗包括3个方面：用于酵母生长及合成；作为酵母自身呼吸代谢；用于产生乙醇[20]。在蔗糖乙醇发酵中根据总糖消耗的碳平衡，结合酵母生长和乙醇生成的动力学模型，得到总糖消耗动力学模型。其模型如下：

(5)

式中：s为总糖浓度，g/L；x为酵母浓度，×108个/mL；p为乙醇浓度，g/L；ms为细胞的维持系数，h-1；Yx/s为酵母相对于总糖的得率系数，108个/g；Yp/s为乙醇相对于总糖的得率系数，g/g；将式(5)积分得：

将s∈(s0, st)，x∈(x0, xt),t∈(0, t)对上面公式积分得：

(6)

利用软件将式(6)进行拟合，代入图1数据后得到总糖消耗动力学曲线，见图4，其相关参数及方差分析表见表5和表6。

图4 总糖消耗试验值拟合曲线Fig.4 The fitting curve of total sugar consumption test values

表5 参数估计值(总糖消耗)Table 5 The parameter estimates (total sugar consumption)

表6 方差分析(总糖消耗)Table 6 The analysis of variance (total sugar consumption)

由图4可知，6 h之后糖消耗速率增大，说明菌体代谢旺盛，乙醇生成量也大量增加，并且总糖实测值几乎都在拟合曲线附近且属于95%置信区间之内。由表5和表6可知，此模型相关系数为0.9975，均方根误差为5.4，F值为2882.53，说明此方程拟合效果好，能较好反映260 g/L蔗糖乙醇发酵过程中总糖消耗的过程变化。

综上，将经过软件模拟的3个方程的动力学参数整合并带入到各自方程中得到动力学方程，见表7。

表7 拟合方程及各自相关系数Table 7 The fitting equations and respective correlation coefficients

2.3 模型数值比较

将各自模型的试验值和理论值进行比较，并用相对误差表示结果的可信度，见表8。

表8 模型试验值和理论值的比较Table 8 Comparison of model experimental values and theoretical values

续 表

由表8可知，除了发酵初期的乙醇试验值与拟合值差距较大外，其余试验值与拟合值相对误差绝大多数在10%以内，所以在此条件下，酿酒酵母GJ2008发酵高浓度蔗糖产乙醇的过程能够用以上发酵动力学模型来表示。

3 结论与展望

就本研究而言，酵母菌发酵0～6 h处于快速生长期的前期，总糖消耗缓慢，酒精生成比较缓慢；发酵6～15 h是酵母菌快速生长期的中后期，菌体活力高，耗糖能力和产乙醇能力增加；在15 h之后，菌体进入稳定期，数量趋于平缓，耗糖能力和产乙醇能力依然很高，说明在高浓度蔗糖乙醇发酵过程中，乙醇不仅在酵母快速生长期的中后期大量生成，稳定期也有相当一部分乙醇生成，33 h之后乙醇量趋于平缓，最大乙醇量为111.17 g/L。

利用Logistic方程和Luedeking-Piret-like方程建立高浓度蔗糖乙醇发酵过程中酵母生长、乙醇生成和总糖消耗的动力学模型，通过Origin 9.5软件对方程进行非线性回归及相关系数分析，得到方程预测值与试验值的数据相关系数R2分别为0.9929，0.9940，0.9975，具有很高的拟合度，表明模型能够较好地说明蔗糖乙醇发酵过程中酵母生长、乙醇生成和总糖消耗的动力学特性。为了更清楚地找到高浓度蔗糖乙醇发酵过程中菌体生长、乙醇生成和总糖消耗的规律，我们在后续会增加不同浓度蔗糖乙醇发酵试验，并对产物生成动力学方程进行优化，通过对不同浓度下拟合的结果进行分析，找到最适合高浓度蔗糖条件下乙醇发酵的动力学方程，对甘蔗汁和甘蔗糖蜜的扩大生产有一定的参考意义。