高效液相法测定5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮中基因毒性杂质盐酸羟胺的含量

2021-09-10陈玉青施海璐兰公剑

四川化工 2021年4期

陈玉青王恩施海璐兰公剑

(南京正大天晴制药有限公司，江苏南京，210046)

基因毒性杂质(genotoxic impurity GTI)是指能直接或间接损害DNA，导致基因突变或具有致癌倾向的物质。其特点是在较低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，具有致突变性和致癌性，严重威胁到人类的健康[1]。随着研究的深入，不断出现已上市药品中痕量的基因毒性杂质残留而发生医疗事故的案例，给药厂造成了巨大的经济损失[2]，更多的药企在新药研发过程中就开始关注基因毒性杂质的控制和检测。

5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮为重要的合成起始原料，可用于替尼类抗肿瘤药物的合成，而5-氟-1H-吲哚-2,3-二酮的合成过程中使用了盐酸羟胺，故可能会引入到原料及其制剂中，盐酸羟胺具有遗传毒性[3]，需要进行控制。目前无文献报道基因毒性杂质盐酸羟胺的测定方法，本文根据盐酸羟胺的结构特点，开发一种HPLC方法，可以准确方便地检测盐酸羟胺的含量。参考ICH指导原则[4]，查询到羟胺PDE值为2μg·day-1，根据该制剂说明书每日最大剂量为117mg，可计算出盐酸羟胺的限度为0.0036%，本文采用将盐酸羟胺衍生化成具有紫外吸收的苯甲醛肟后再进行检测，反应方程式见图1。

图1 衍生化反应方程式

1 仪器与试药

1.1 仪器

表1 仪器

1.2 试剂与试药

见表2。

表2 试剂与试药

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.2 溶液配制

2.2.1 衍生化试剂贮备液

精密量取苯甲醛2mL，置于100mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 衍生化试剂溶液

精密量取衍生化试剂贮备液1mL，置于20mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

2.2.3 对照品贮备液

取盐酸羟胺对照品5mg，精密称定，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1mL，置于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

2.2.4 对照品溶液

精密量取对照品贮备液2mL，置于10mL量瓶中，精密加入衍生化试剂溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，室温放置反应1h。

问题5-2 在等差数列{an}中，Sn为其前n项和，则数列S3,S6-S3,S9-S6,…是等差数列.试证明上述结论，并通过类比，找出等比数列的相关结论.

2.2.5 供试品溶液

取本品0.1g，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置于10mL量瓶中，精密加入衍生化试剂溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，室温放置反应1h。

2.2.6 加标供试品溶液

取本品0.1g，置于10mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置于10mL量瓶中，依次精密加入对照品贮备液2mL、衍生化试剂溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，室温放置反应1h。

2.3 专属性

分别精密量取空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，空白溶剂不干扰盐酸羟胺测定，供试品溶液中盐酸羟胺未检出，方法专属性良好，结果见图2。

图2 专属性试验图谱

2.4 检测下限与定量下限

取对照品贮备液，逐级稀释，按信噪比不小于10时作为定量下限溶液。盐酸羟胺的定量下限为0.03μg·mL-1(相当于限度浓度16.6%)，连续进样6次，其峰面积RSD为7.5%，表明定量下限精密度良好。

取对照品贮备液，逐级稀释，按信噪比不小于3时作为检测下限溶液，盐酸羟胺的检测下限为0.01μg·mL-1(相当于限度浓度5.5%)，表明本方法灵敏度良好，满足检测要求。

2.5 线性范围考察

精密移取2.2项下对照品贮备液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，分别置于10mL量瓶中，再分别精密加入苯甲醛溶液1mL，用水稀释至刻度，摇匀，放置1h，作为系列浓度对照品溶液。精密量取上述溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度(μg·mL-1)为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。盐酸羟胺线性方程为：y=91894x+531.53；相关系数r=0.9991，结果表明盐酸羟胺浓度在0.05～0.44μg·mL-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.6 进样精密度

精密量取对照品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6针，记录色谱图，盐酸羟胺峰面积的RSD为0.2%，结果表明进样精密度良好。

2.7 重复性与准确度

准确度是向供试品溶液中添加已知量的杂质对照品，并设计成相当于杂质限度50%、100%、150%水平的3种浓度，每种浓度制备3份，采用9份样品进行评价，以测得的杂质含量与加入量的比值表示回收率，同时考察方法的重复性，不同浓度水平的加标供试品溶液中盐酸羟胺回收率均在90%—110%之间，平均回收率为99.9%，RSD为0.9%，结果表明方法准确度和重复性良好。