二甲双胍对阿尔茨海默病大鼠的疗效及机制研究

王健蓉， 许 毅， 刘 斌， 刘奕杉

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是老年人最为常见的神经退行性疾病，因其明显的大脑葡萄糖和能量代谢损伤，亦被称为“3型糖尿病”[1]。而二甲双胍是一种广泛应用于2型糖尿病的治疗药物。由此我们推测，二甲双胍在AD患者的治疗中可能具有很大的潜力，而目前尚缺乏相关研究报道。

AD的典型病理特征是细胞外β淀粉样蛋白(Amyloid β peptide，Aβ)沉积和神经元胞浆中tau蛋白过度磷酸化导致的神经元纤维缠结(Neurofibrillary Tangles，NFTs)[2]。 tau蛋白的磷酸化主要由糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)参与调控[3]。而GSK3β的活性又受磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B，PKB/AKT)的影响[4]。

本研究拟采用二甲双胍对AD模型大鼠进行干预，通过Morris水迷宫和Western blot等方法，观察该药物对AD模型大鼠学习记忆能力的治疗效果，并基于“PI3K-AKT-GSK3β-tau磷酸化”信号通路，探讨二甲双胍可能的作用机制，以期为AD患者寻找更为安全有效的临床治疗药物。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 50只健康成年雄性SD大鼠(体质量约240～280 g)，均由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(川)2020-030。全部大鼠饲养于自然光照的SPF级饲养室(温度25 ℃，湿度60%～70%)，自由进食、饮水。通过Morris水迷宫实验测试，剔除掉可能天生痴呆及不会游泳的大鼠后(详见1.3 动物模型制备)，按照随机数字表法将全部大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和治疗组，每组各12只。所有操作均遵循《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

1.2 主要仪器与试剂 Morris水迷宫(RWD公司)；酶标仪、低温离心机(Thermo公司)；电泳仪、电泳槽、凝胶成像仪(Bio-Rad公司)；切片机、光学显微镜(Leica公司)；Cell Sens Standard图像采集系统(Olympus公司)。Aβ25-35(sigma公司)；盐酸二甲双胍、Tween80(生工生物工程有限公司)；苏木素溶液、伊红染色液(北京索莱宝科技有限公司)；PI3K(P110α)、AKT、tau(phospho S202)以及tau5单克隆抗体(abcam公司)；GSK3β、P-GSK3β(Ser9)、P-AKT(Ser473)单克隆抗体(CST公司)；β-actin单克隆抗体(Bioworld Technology)；山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(Earthox Life Science)；蛋白酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.3 动物模型制备 用生理盐水稀释Aβ25-35至2 g/L浓度，37 ℃水浴箱中孵育1 w后分装为10 μl/管，于-20℃冰箱中保存。3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射深度麻醉大鼠后，按照脑立体定位图谱对双侧海马进行定位(前囟后4.1 mm，左右各旁开3 mm，深度4 mm)并钻小孔，随后用微量注射器给每侧海马缓慢注射5 μl Aβ25-35。术后3 d予以碘伏消毒伤口，并肌注青霉素G(10万U)预防感染。参照先前研究[5]使用Morris水迷宫实验对各造模后大鼠进行模型评价，其中平均逃避潜伏期及搜索路径较正常组和假手术组明显延长且空间探索实验中跨越平台次数明显减少者，视为模型制备成功。假手术组：双侧海马注射等量生理盐水。

1.4 药物制备及干预措施 药物制备：将盐酸二甲双胍粉末用1% Tween 80溶解，4 ℃保存待用[6]。治疗组大鼠造模成功后第2天，按照100 mg/(kg·d)给予二甲双胍灌胃治疗，连续给药2 w。以上实验操作，均由固定人员在固定时间内进行。

1.5 实验方法

1.5.1 Morris水迷宫实验 二甲双胍干预结束后次日，采用Morris水迷宫对各组大鼠学习和记忆能力进行评定。水迷宫直径2 m，深度0.6 m，均分为4个象限，水中温度保持在25 ℃。上方安置摄像机，与电脑图像采集系统相连。(1)可视平台实验：第1～2天，平台位于第Ⅲ象限中央水面上约0.5 cm，将各组大鼠按照编号从4个象限依次放入水中，每轮实验间隔30 min。记录1 min内它们找到平台的时间(逃避潜伏期)及搜索路径。若超过1 min仍未找到平台，其逃避潜伏期则记录为1 min。(2)隐蔽平台实验：第3～6天，平台位于第Ⅲ象限中央水面下约0.5 cm。其余与可视平台实验相同。(3)空间探索实验：第7天，撤除平台，同样依次放入各组大鼠，记录1 min内各组大鼠穿越原平台位置的次数。

1.5.2 标本采集 水迷宫实验结束后，大鼠腹腔注射过量3%戊巴比妥钠麻醉后，心尖灌注预冷的生理盐水，完整剥离脑组织。一侧放入4%多聚甲醛(4 g/100 ml)溶液中固定24 h～48 h;另一侧剥离海马组织后，称重，用于提取蛋白。

1.5.3 苏木素伊红染色 将固定好后的组织块梯度乙醇脱水，用石蜡包埋并作连续冠状切片，厚度4 μm，常温保存。二甲苯常规脱蜡，乙醇水化后，苏木素常温染核10 min，再用伊红染色2 min，自来水冲洗反蓝，随后70%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水，各3 min。二甲苯透明后中性树胶封片，使用光镜观察并拍照分析。

1.5.4 Western blot 取50 μg总蛋白上样，常规电泳电转。并将转印好的PVDF膜置于WB封闭液中37 ℃封闭2 h，随后分别放入β-actin(1∶5000)、PI3K(1∶1000)、AKT(1∶10000)、P-AKT(1∶1000)、GSK3β(1∶1000)、P-GSK3β(1∶1000)、tau[pS202](1∶1000)、tau5(1∶1000) 等一抗孵育液中，4 ℃过夜。次日洗涤条带后，用1∶10000稀释的二抗于37 ℃孵育1 h后，再次洗涤，超敏ECL显影液发光，凝胶成像系统进行采图。使用Quantity one测量各条带灰度值，并将目标蛋白灰度值与内参灰度值的比值记为目标蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 Morris水迷宫实验 结果示意图(见图1A)。(1)可视平台实验：各组间平均逃避潜伏期和搜索路径无明显差异(P>0.05)(见图1B、C)。(2)隐蔽平台实验：模型组大鼠平均逃避潜伏期和搜索路径均明显高于正常组和假手术组(正常组和假手术组间无明显差异)，二甲双胍治疗后上述指标明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1E、F)。(3)空间探索实验：模型组大鼠穿越平台次数明显低于其余各组，差异有统计学意义(P<0.05)(见图1D)。

与正常组比较*P<0.05；与假手术组比较@P<0.05；与模型组比较#P<0.05

2.2 苏木素伊红染色 各组大鼠海马区域形态结构完整，细胞形态规则，没有明显差异(见图2)。

图2 各组大鼠海马区苏木素伊红染色结果只鼠/组)

2.3 Western Blot 首先，tau[pS202]/tau5在模型组大鼠海马组织中明显高于正常组和假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，经二甲双胍干预后，tau[pS202]/tau5显著下降(P<0.05)(见图3A、B)。同时，模型组大鼠海马组织中PI3K的相对表达量及P-AKT(Ser473)/AKT和P-GSK3β(Ser9)/GSK3β明显低于正常组和假手术组；而与模型组相比，治疗组大鼠上述指标明显上调，差异亦具有统计学意义(P<0.05)(见图3A、图C～E)。

与正常组比较*P<0.05；与假手术组比较@P<0.05；与模型组比较#P<0.05

3 讨 论

随着人口老龄化的日益加重，AD的发病率呈逐年增加的趋势。因此，AD的预防和治疗已然成为全球关注的焦点。据统计，2015年，全球用于AD患者的防治费用达9575.6亿美元，预计2050年，这一数字将达到9.12万亿美元[7]。目前批准临床用于AD患者治疗的药物均只能改善临床症状，几乎所有逆转或阻止AD疾病进展的临床试验都以失败告终[8]。因此，寻找更为安全有效的治疗方法则显得尤为重要。AD被称为是“大脑中的糖尿病性疾病”[9]。那么用于糖尿病治疗的临床一线药物“二甲双胍”是否能够有效提高AD模型动物的学习记忆能力？其潜在的机制又是什么呢？本研究进行了初步的探讨。

众所周知，近年来tau蛋白过度磷酸化所形成的NFTs是AD发病机制研究的重点之一，蛋白激酶和磷酸酶的失衡是引起tau蛋白异常磷酸化的主要原因[10]，其中GSK3β备受关注[11]。大量证据表明，GSK3β是PI3K/AKT的下游靶标。PI3K同时具有丝氨酸/苏氨酸激酶和磷脂酰肌醇激酶的活性；当PI3K被激活时，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇 (phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)会作为第二信使在细胞膜上产生；随后作用于AKT蛋白使其磷酸化并激活[12,13]。活化后的AKT与GSK3β结合，诱导GSK3β进入细胞膜，磷酸化其N端Ser9非活性位点[14]，使GSK3β失活，进而影响GSK3β的下游底物如tau蛋白和胰岛素受体等[15]。

本实验结果与上述研究内容基本一致，二甲双胍发挥着激活PI3K/AKT，降低GSK3β活性并减少tau蛋白过度磷酸化，从而改善AD模型大鼠认知的作用。SD大鼠双侧海马注射Aβ25-35后水迷宫各项数据明显增高，提示模型制备成功，AD模型大鼠学习记忆能力显著下降。经过二甲双胍为期2 w的干预，AD模型鼠认知障碍有所改善。另外，虽然苏木素伊红染色结果表明各组大鼠海马区细胞基本形态结构无明显差异，但Western blot 结果显示，AD模型大鼠海马组织中PI3K、P-AKT/AKT、P-GSK3β/GSK3β的表达显著减少，而tau[pS202]/tau5则明显上调。通过二甲双胍药物治疗后，上述指标均大致恢复至正常组大鼠海马组织中的表达水平。综上，我们首次通过行为学，形态学和分子学实验证明，二甲双胍在神经退行性疾病的治疗方面可能发挥着特殊的作用，而其潜在分子机制可能与“PI3K-AKT-GSK3β-tau蛋白磷酸化”信号通路密切相关。

这一结果引发了作者更多的思考，GSK3β是否能够作为糖尿病和AD的潜在联系点呢？我们能否以此为切入点，为糖尿病和AD共病患者的治疗提供一些新的思路呢？通过查阅文献，我们发现，糖尿病患者的AD风险是正常人的两倍以上[16]。胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是2型糖尿病最主要的特征，近年来大量研究表明，其可能间接导致GSK3β活性增加从而加剧AD的发病进程[17,18]。目前，一些GSK3β抑制剂已作为AD的治疗药物进入二期临床试验[19]。基础研究也发现，GSK3β抑制剂(如：靛玉红)能使高脂饮食诱导的认知障碍大鼠学习和记忆能力得到提高[20]。结合我们的实验结果，二甲双胍虽然并非GSK3β的特异性抑制剂，但在AD的治疗方面却发挥着相类似的作用。而且，二甲双胍作为糖尿病的临床一线治疗药物，具有安全、有效、经济且方便购买等优势。这一发现对AD患者尤其是合并糖尿病的AD患者将可能是巨大的福音，但其具体机制及临床研究尚待进一步开展。