3种连续旋转镍钛系统对感染根管内粪肠球菌清除效果的比较

游月华，叶惟虎

1南方医科大学附属龙华人民医院口腔科，广东 深圳 518109；2南方医科大学口腔医学院，广东 广州 510515；3华中科技大学同济医学院附属同济医院口腔医学中心，湖北 武汉430030

细菌的存在与根管感染及根尖周炎之间存在因果关系［1-3］。根管治疗的临床目标是通过机械和化学手段大量减少根管系统内的细菌，并采用充填材料将根管系统严密封闭，从而促进根尖周病变的愈合［4,5］。连续旋转镍钛机用器械是目前口腔临床应用最广泛的机械预备器械。ProTaper Gold（2014）采用经典的凸三角形截面和渐进锥度，增强了切削作用，同时减少了器械刃部与牙本质之间的旋转摩擦［6］，表现出不同的相变行为和循环疲劳抗性［7］。ProTaper Next（2013）则通过独特的矩形截面设计、渐进锥度及偏轴心运动，使其在工作时与管壁保持两点接触，从而提高根管成形效率和循环疲劳抗力［8-10］。以上两种渐变锥度旋转镍钛系统均可通过机械预备大量减少感染根管内的微生物负载量［11,12］。

重度弯曲根管的充填更推荐应用单尖法充填技术，而使用固定锥度的镍钛器械预备及与之匹配锥度的牙胶尖进行单尖充填可获得更好的封闭效果［13］。EZ Pass（2020）是近期引入牙髓病学临床的一套新型固定锥度连续旋转镍钛系统，采用高相变温度镍钛合金丝，以机械磨削和MaxtTech 6.0热处理工艺制成。EZ PASS在常温下以R相为主，并含有少量奥氏相，其预弯性能和抗循环疲劳能力均显著提高。EZ Pass系统由5支单一固定锥度的器械组成，其横截面形态为经典的凸三角形。目前，有关EZ Pass清除感染根管内细菌的研究尚未见报道。本研究的目的是通过根管内取样和琼脂板菌落计数技术比较新型固定锥度连续旋转镍钛系统EZ Pass 与两种传统的渐变锥度连续旋转镍钛系统（ProTaper Gold及ProTaper Next）对体外构建的上颌中切牙感染根管内粪肠球菌的清除效果。

1 材料和方法

1.1 实验器材

T+File顺滑通路锉（深圳速航）；EZ Pass（深圳速航）；ProTaper Gold（Dentsply Maillefer）；ProTaper Next（Dentsply Maillefer）；X-Smart Plus 根管马达（Dentsply）；ProRinse®30G冲洗针头(Dentsply Tulsa)；硅橡胶印模材料(Kerr)；紫外分光光度计（BioMate 3S，Thermo Scientific）；涡旋振荡器（Thermo Scientific）；37 ℃恒温培养箱（北京福意）。

1.2 菌株与试剂

粪肠球菌（ATCC 29212）；牛脑心浸液培养基（Millipore Sigma）。

1.3 样本来源

选择因牙周病或正畸而新鲜拔除的单根上颌中切牙51颗。纳入标准：牙齿外形正常，无明显龋病、缺损或充填物，经X线片和显微镜下识别为单根管。去除牙根表面的软组织及牙结石，储存于4 ℃含0.02%NaN3的生理盐水中。该研究获得华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准。

1.4 样本制备

对所收集的51颗离体牙进行开髓、疏通根管，运用ProTaper Gold Sx锉进行根管冠部预敞开，以切缘至根尖孔的距离减去1 mm为工作长度，以T+File（16/02）制备顺滑通路，以ProTaper Gold将根管预备至F2。每次更换器械时，依次以2 mL 2%NaClO和2 mL 0.9%NaCl冲洗根管；机械预备完成后，先后用5 mL 2%NaClO、1 mL 5%Na2S2O3、3 mL 17%EDTA和6 mL 0.9%NaCl进行根管冲洗。本研究全程采用ProRinse®30G单侧开口冲洗针头，针头距根尖止点不少于2 mm。将样本放入装有硅橡胶印模材料的5 mL离心管内，注入2 mL BHI培养基，高温高压灭菌。

1.5 根管感染模型的建立

参照本课题组前期研究，建立上颌中切牙根管感染模型［14,15］。将单克隆粪肠球菌菌落接种至10 mL脑心浸液培养液中，于37 ℃有氧培养5 h后将菌液稀释为1×108/mL的菌悬液。以2 mL菌悬液注入离体牙根管，将样本完全浸没；于37 ℃恒温培养箱中有氧培养21 d，每隔1 d换液1次。

1.6 根管内细菌染色及光镜观察

参照本课题组前期研究［14,15］，随机选择1个感染标本，切除牙冠和根尖，获得一个圆柱形牙本质块。将切下的标本固定在4%的多聚甲醛中，在10%的甲酸/甲酸钠中完全脱矿后进行石蜡包埋处理，垂直于牙体长轴进行横向切片（层厚5 μm），并用Taylor改良的Brown&Brenn技术进行染色［16］。将切片置于光镜下（放大20倍；Axioplan 2荧光成像显微镜；Zeiss，德国），对根管壁上的生物膜细菌进行定性观察；随机选取了10个牙本质切片，在每个切片上取5个位点进行最大细菌渗透深度的测量，取其平均值为该切片的最大细菌渗透深度值。

1.7 根管内取样和菌落计数

在根管感染模型建立后即对剩余的50个样本进行首次根管内取样（S1）［18］。以15#K锉在根管内提拉切削30 s，并用500 μL生理盐水冲洗根管。使用小型注射器将根管内液体收集于5 mL的离心管中，涡旋振荡30 s，倍比稀释，取50 μL稀释菌液涂布于脑心浸液琼脂板，有氧培养48 h后进行菌落计数。

1.8 感染根管内细菌的清除

首次根管内取样（S1）后，将剩余的50个样本随机分为以下5组（n=10），以机械和化学手段清除根管内细菌：EZ Pass组：设定X-Smart Plus根管马达的转速为350 r/min,扭矩为1.5 N.cm，依次用P2（15/04）、P3（20/04）和P4（20/06）以单一长度技术扩大根管；随后将参数调至350 r/min和3.0 N.cm，将根管扩大成形至P5（25/06）。ProTaper Gold组：设定马达为“ProTaper”模式，依次用S1（17/02）、S2（20/04）、F1（20/07）和F2（25/08）以单一长度技术将根管扩大成形。ProTaper Next组：设定马达为“ProTaper”模式，依次用X1（17/04）和X2（25/06）以单一长度技术扩大成形根管。2%NaClO组：不机械预备，仅以2%NaClO进行化学预备。0.9%NaCl组（阴性对照组）：不机械预备，仅以0.9%NaCl冲洗根管。

每个样本使用的冲洗液总量为16 mL。其中EZ Pass组、ProTaper Gold组、ProTaper Next组、2%NaClO组冲洗顺序和冲洗液量如下：先以6 mL 2%NaClO冲洗根管，随后以2 mL 5%Na2S2O3中和根管内残存的次氯酸钠及2 mL 17% EDTA 去除玷污层，并以6 mL 0.9%NaCl进行终末根管冲洗。0.9%NaCl组（阴性对照组）每个样本仅用16 mL 0.9%NaCl进行冲洗。完成上述机械及化学预备后，对50个样本全部进行第2次根管内取样（S2）。计算根管内细菌减少率（%）和对数减少量（log10CFU）。

1.9 统计学方法

应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，所有数据均以平均值±标准差表示，并进行正态性和方差齐性检验。采用单因素方差分析比较各组初次取样后的根管内细菌量的差异。采用单因素方差分析比较各组间根管内细菌减少率和对数减少值，显著性水平α=0.05。

2 结果

经过3周的培养，光镜下观察到根管表面可见广泛的粪肠球菌生物膜，同时已有大量的细菌渗入牙本质小管深层；细菌存在于大多数牙本质小管中，并堵塞了根管壁上的牙本质小管开口。粪肠球菌进入牙本质小管的最大深度平均值为475 μm（图1A、B）。

图1 代表性Taylor改良的Brown&Brenn染色光镜下人工感染根管的牙齿牙本质小管内的粪肠球菌影像Fig.1 Taylor-modified Brown and Brenn-stained light microscopy images of E.faecalis within the dentinal tubules of a tooth with infected root canals.A:Bottom area of the buccal canal;B:Isthmus area.

0.9%NaCl 组、2%NaClO组、EZ Pass组、ProTaper Gold组、ProTaper Next组感染根管内细菌量基线值分别为7.28×109、7.19×109、7.35×109、6.96×109、7.01×109CFU/mL，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

进行根管内细菌清除处理后，EZ Pass组、ProTaper Gold组、ProTaper Next组、2%NaClO组细菌减少率的组间差异无统计学意义（P＞0.05，89.5%～98.2%），但均显著高于阴性对照组[（54.50±2.4）%]（图2）；EZ Pass组（1.47±0.12）、ProTaper Gold组（1.74±0.14）及ProTaper Next组（1.63±0.17）根管内细菌对数减少值的组间差异无统计学意义（P＞0.05），但均显著高于2%NaClO组（0.98±0.08）（P＜0.05）；以上4组的对数减少值皆显著高于阴性对照组（0.34±0.03）（P＜0.01，图2）。

图2 使用5种方法对感染根管行机械化学清理后主根管内CFU计数的减少Fig.2 Effects of root canal disinfection for CFU reduction in the main canals with the 5 antibiofilm strategies(Mean±SD).CFU reduction rate(%):*P＜0.001 vs 0.9%NaCl;Log10 CFU reduction:*P＜0.001 vs 0.9%NaCl,*P＜0.001 vs 0.2%NaClO.

3 讨论

微生物侵入牙髓腔并以生物膜的形式长期存在，被认为是根管治疗失败和根尖周炎持续存在的主要原因［1,14］。理论上根管预备的生物学目标是清除根管系统内的所有微生物［17］，但临床实践中往往要在清除感染和保存牙体组织之间达到一个平衡，以最终长期保存患牙，实现其美学和功能［4］。

根管感染模型建立前应将所有样本根管制备形成统一的根尖直径和锥度，并使用次氯酸钠冲洗清除根管内残存的微生物，为避免次氯酸钠延迟作用过度抑制粪肠球菌生长，还需使用5%Na2S2O3冲洗中和以及17%EDTA去除玷污层，最后0.9%NaCl终末冲洗消除所有冲洗液对建模的影响。粪肠球菌是经过长期研究验证的根管感染研究模型菌种，不论有氧或无氧条件，其均能在离体牙根管内形成成熟的生物膜结构［18］。本课题组前期研究表明［14,15］，采用有氧培养技术能成功构建成熟的根管内粪肠球菌生物膜模型。

本研究评估了固定锥度的新型连续旋转镍钛系统EZ Pass对根管内粪肠球菌的清除效果，并与渐变锥度的镍钛系统ProTaper Gold 及ProTaper Next 作比较。研究结果显示，2%NaClO组根管内细菌减少了89.50%，其对数减少值为0.98，显著高于阴性对照组；这表明次氯酸钠冲洗是清除感染根管内细菌的有效手段［19,20］。本研究中EZ Pass组、ProTaper Gold组、ProTaper Next组与2%NaClO组所使用的冲洗液种类、浓度和体积是一致的，结果显示3个机械化学预备组根管内细菌减少对数值的组间差异无统计学意义（P＞0.05），却均显著高于单纯的化学预备组（2%NaClO组）（P＜0.05）；这表明使用EZ Pass、ProTaper Gold和ProTaper Next进行机械预备均可显著减少根管内细菌量，三者的细菌清除能力相当。本研究结果显示，ProTaper Gold组根管内细菌减少率为98.20%，ProTaper Next组减少率为97.70%；这与部分研究［10,11,17］结果基本一致，这两种镍钛器械的根管内细菌减少率都不低于95%。

研究结果显示，0.9%NaCl组根管内细菌减少率和对数减少值均显著低于各机械化学预备组或单纯化学预备组（P＜0.05）。然而，尽管未使用任何机械或化学预备手段，阴性对照组根管内细菌量却降低了54.5%，这主要是因取样时K锉对根管壁上微生物的机械切削作用和生理盐水的流体动力学冲刷作用所致［14,15］。

无论是基于何种形态设计、热机械处理工艺和运动方式，镍钛器械都是在根管内绕着某个轴心进行环形切削。然而，根管横截面形态是沿着牙根长轴方向不断变异的，没有哪一种器械或技术可将所有的根管壁表面都切削到［21,22］。再者，细菌往往以生物膜的形式广泛存在于根管交通支及侧支等器械无法到达的不规则区内［23］。因此，交替使用机械和化学手段进行根管内细菌清理显得尤为重要。

综上所述，新型连续旋转镍钛系统EZ Pass可显著减少感染根管内的细菌负载量，其根管内细菌清除能力与ProTaper Gold和ProTaper Next相当，值得临床推广应用。