慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞水平与肝纤维化的相关性

李兰亚 伍广 屠涛 张丽

研究表明，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者病情恶化与免疫功能损害有一定联系，对患者预后情况也有影响[1]。有研究发现，非特异性免疫对抑制CHB病情的发展也有重要作用[2]。而自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)属于非特异性免疫的一部分，可能也参与或推动了CHB肝纤维化的发生[3-4]。本研究通过分析外周血NK细胞表达水平对CHB患者肝纤维化的影响及预测价值，以指导未来CHB患者肝纤维化的风险评估与干预。

资料与方法

一、一般资料

选取2017年3月至2020年2月收治的83例CHB患者作为研究对象。本研究经医院医学伦理委员会审核通过，患者与家属均知情且自愿签署同意书。研究对象中，男性46例，女性37例；年龄22～56岁，平均年龄(40.59±7.50)岁；体质指数18.12～24.75 kg/m2，平均体质指数(21.57±1.89)kg/m2；病程1～15年，平均病程(5.98±3.82)年。

纳入标准：①符合《CHB防治指南(2015年版)》[5]中CHB诊断标准；②经病理学、实验室检查等确诊为CHB；③肾、肺等重要脏器检查正常；④无血液系统疾病或凝血功能障碍。排除标准：①合并甲、丙等其他肝炎病毒感染；②合并自身免疫性肝病或者酒精性肝病；③合并恶性肿瘤；④既往半年曾使用肾上腺皮质激素、抗病毒药物等。

三、研究方法

(一)基线资料收集方法 比较基线资料，包括性别(男/女)、年龄、体质指数[体质指数=体质量(kg)÷身高(m)的平方]、病程、家族史、吸烟史(根据世界卫生组织定义，吸烟者为一生中连续或累积吸烟6个月或以上者)、饮酒史(世界卫生组织定义10～30 g/d为适量饮酒)等。

(二)血清学相关指标检测方法 入院时，采集1 mL外周静脉血，EDTA-K2抗凝，100 μL EDTA-K2抗凝血加入20 μL的CD16+56+PE并混匀，15～20 min的室温避光孵育，上机溶血，使用流式细胞仪(安捷伦公司，NOVOCYTE D2040R型)测定CD16+56+水平阳性细胞占比，以代表NK细胞的含量。

(三)肝纤维化评估方法及分组 根据Scheuer评分系统[6]评估，进行S(纤维化分期，分0～4期)分级，S0表示无肝纤维化，S1～S2表示轻度肝纤维化，S3表示中度肝纤维化，S4表示重度肝纤维化。将S0级无肝纤维化的患者纳入对照组，其他纳入肝纤维化组。

四、统计学分析

结 果

一、肝纤维化结果及基线资料比较

本研究纳入的83例CHB患者中，57例患者发生肝纤维化，肝纤维化发生率为68.67%(57/83)。对比肝纤维化组与对照组基线资料发现，两组性别、年龄、体质指数、病程、家族史、吸烟史、饮酒史比较，差异无统计学意义(P>0.05)；肝纤维化组外周血NK细胞水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

二、外周血NK细胞水平影响CHB患者肝纤维化的Logistic回归分析结果

(一)二元Logistic回归分析 将外周血NK细胞表达水平作为协变量，将CHB患者肝纤维化作为因变量(1=发生肝纤维化，0=无肝纤维化)，经二元Logistic回归分析结果显示，外周血NK细胞低表达可能是CHB患者肝纤维化的影响因素(OR>1，P<0.05)。见表2。

(二)多元回归分析 将外周血NK细胞表达水平作为协变量，将CHB患者肝纤维化作为因变量(1=发生肝纤维化，0=无肝纤维化)，同时将其他基线资料(性别、年龄等)纳入，校正其他基线资料带来的影响并构建多元回归模型行多因素分析发现，外周血NK细胞低表达是CHB患者肝纤维化的独立危险因素(OR>1，P<0.05)。见表3。

表1 两组基线资料比较

表2 外周血NK细胞水平影响CHB患者肝纤维化二元Logistic回归分析结果

表3 外周血NK细胞水平影响CHB患者肝纤维化二元Logistic回归分析结果

三、外周血NK细胞水平预测CHB患者肝纤维化风险价值

绘制ROC曲线(图1)发现，外周血NK细胞预测CHB患者肝纤维化风险的AUC为0.842(95%CI：0.759～0.924，P<0.001)，有一定预测价值，最佳阈值9.12%、特异度0.731、灵敏度0.985、约登指数0.716。

图1 外周血NK细胞水平预测CHB患者肝纤维化风险的ROC曲线图

讨 论

研究表明，CHB患者发生肝纤维化风险高[7]。本研究结果显示，83例CHB患者中57例患者发生肝纤维化，肝纤维化发生率为68.67%(57/83)，与上述研究结论一致。NK细胞是人体免疫系统中的效应细胞，在抗感染免疫方面具有重要作用。以往通常认为，细胞毒性T淋巴细胞反应是导致CHB患者肝损伤和肝纤维化进展的重要因素，但近年来研究表明，NK细胞对肝脏疾病的发展具有推进作用，与CHB关系紧密[8]。由此推测，NK细胞表达水平的高低可能也会对CHB患者肝纤维化造成影响。本研究初步对比肝纤维化组与对照组基线资料发现，肝纤维化组外周血NK细胞表达水平低于对照组。分析原因可能为：NK细胞水平的波动可能受乙肝病毒所影响，引起NK细胞再分布，表现为NK细胞选择性集中于肝脏内，减少了外周血中的NK细胞含量[9-10]。CHB伴随炎症反应，随着炎症反应的发生发展，部分炎性因子迁移至肝脏，肝脏受到侵犯后大量募集NK细胞，造成外周血NK细胞水平降低[11-12]。而发生肝纤维化的CHB患者相对炎症反应更为严重，因此肝纤维化组患者外周血NK细胞水平低于无肝纤维化的患者[13]。

本研究初步对比了肝纤维化患者与无肝纤维化患者基线资料及外周血NK细胞水平，并做二元Logistic回归分析后建立多元回归模型行多因素分析，结果显示，外周血NK细胞低表达可影响CHB患者肝纤维化，且经ROC检验证实，外周血NK细胞含量用于预测CHB患者肝纤维化的发生风险均有理想价值。分析原因可能为：NK细胞对肝炎具有抗病毒感染的功能，通过合成细胞毒物质，如颗粒酶，参与溶解和破坏靶细胞并达到杀伤作用[14]。NK细胞是淋巴细胞浸润的一种特异性细胞，在外周血中表达水平降低是由于其集中于肝脏中，引起NK细胞在肝脏浸润中过度应答反应，造成肝细胞破坏和肝脏损伤，导致肝细胞的坏死，从而引起肝纤维化[15-16]。同时，NK细胞在肝脏内聚集后，NK细胞表达活性的增加会造成肿瘤坏死因子-α、γ干扰素的释放，进一步加重炎性反应，诱导肝纤维化的发生发展[18]。因此，外周血NK细胞表达对CHB患者的肝纤维化发生有一定影响。

综上所述，外周血NK细胞低表达可能与CHB进程相关，影响肝纤维化发生，早期检测外周血NK细胞水平可预测CHB患者与肝纤维化风险并指导早期干预，可能对改善患者预后有积极意义。