均匀设计法对临床方剂胃肠炎宁颗粒组方优化研究

浦仕彪，王钺涵，杨竹雅，刘 录，周志宏

(云南省高校中药饮片工程研究中心 云南中医药大学，云南 昆明 650500)

胃溃疡是临床上常见的一种急、慢性消化系统疾病，由各种致病因子的共同作用，使胃粘膜发生炎性反应、坏死及脱落，进而形成溃疡，其粘膜缺损坏死穿透粘膜肌层，甚至达到固有肌层及更深处，多表现为嗳气、反酸、饥饿不适、中上腹胀闷、疼痛等，可发生出血、穿孔、幽门梗阻，甚至癌变等并发症，常反复发作[1].胃溃疡病因复杂，是综合因素的结果，与遗传、精神、饮食、化学、感染、环境等因素相关[2].现代医学普遍认为胃溃疡的形成是胃粘膜的攻击因子与防御因子失衡所致[3]，攻击因子包括胃酸、胃蛋白酶、幽门螺杆菌、非甾体抗炎药等；防御因子包括胃粘膜、胃粘液、碳酸氢盐、前列腺素、细胞更新和上皮生长因子等.胃溃疡的愈合包括了粘膜层及粘膜下层组织结构的重生、正常生理结构的重建、粘膜层防御功能的恢复等，涉及多种细胞和分子的相互作用，是一个自发的并且非常复杂的过程，其中包含很多不同机制，影响着疾病的发展与转归.目前临床治疗胃溃疡的常用手段主要有抗幽门螺杆菌治疗、经典的H2受体拮抗剂(雷尼替丁、法莫替丁等)、质子泵抑制剂(如奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑等)、胃粘膜保护剂(硫糖铝、铝碳酸镁、前列腺素)、胃肠动力药(多潘立酮、莫沙必利)等[4-5].尽管西药靶点明确、疗效肯定，但停药后年复发率高达50%～70%，且长期使用有较大安全隐患，如近年来发现奥美拉唑的致癌性、雷尼替丁原料的基因毒性、粘膜保护剂引起的腹泻，以及瑞巴派特和替普瑞酮所致的白细胞减少、肝功能损害等，给需要长期、反复用药的胃溃疡患者带来了潜在的安全隐患.

胃溃疡属于西医病名，中医古籍中并无与之相应的病名，但其症状与中医的“胃脘痛”、“痞满”、“吐酸”、“嘈杂”等病证相合，可将其归属于上述病证范畴，并认为主要由饮食不节、寒温失调、情志不畅、损伤脾胃引起，其发病机制较为复杂[6].由于中医药对胃溃疡的病因病机分析、临床表现、药物治疗上均有独特见解，在预防和治疗方面有着丰富的临床经验和临床疗效，特别是近年来中药对胃粘膜保护作用的实验研究取得了较大进展，为中药治疗胃溃疡提供了越来越多的证据[7].目前临床对胃溃疡的治疗主要包括西医、中医和中西医联合治疗3个方面，相比于西医近期疗效好但远期复发率高和副作用多，中医中药在消除胃溃疡攻击因子等方面显示了优势，其高治愈率、高愈合质量及较强的抗复发作用，为胃溃疡的治疗及防止复发提供了更有效的方法[8-9]，并具有安全性高、价格较低等特点，越来越受到患者青睐.

胃肠炎宁颗粒是我省已故名中医吴生元教授的临床经验方，由美洲大蠊、白芨和铁皮石斛三味药组成，具有抗菌消炎、保护消化道粘膜、收敛止血、促进溃疡组织修复、养阴健胃等作用，对消化性溃疡疗效显著.为了将该方继续发扬光大，让更多胃溃疡患者获益，对其进行院内制剂的开发具有积极的社会意义.本文拟采用均匀设计试验方法，通过简单、经济、经典的乙醇致小鼠急性胃溃疡模型，进行组方优化，为院内制剂开发明确方剂组成.

1 仪器与试剂

DENVER INSTRUMENT电子分析天平，HX602Z型电子天平，248WBJV型海尔冰箱，Milli-Q Integral 超纯水机，量筒、烧杯、剪刀、计时钟等均为国产.

无水乙醇，分析纯，含量≥99.7%，500 mL /瓶，天津市风船化学试剂科技有限公司出品，批号20180707；0.9%氯化钠注射液(生理盐水)，国药准字H53020469，500 mL/瓶，昆明南疆制药有限公司出品，批号A170114d；甲醛(37%～40%)，分析纯，500 mL/瓶，广东光华科技股份有限公司，批号20171018；磷酸二氢钠，分析纯，500 g/瓶，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20151222；磷酸氢二钠，分析纯，500 g/瓶，天津市风船化学试剂科技有限公司，批号20170204.10%中性福尔马林溶液(分别称取磷酸二氢钠 4.000 2 g 及磷酸氢二钠 6.500 3 g，加入纯水溶解、稀释至约 800 mL，再加入甲醛溶液(37%～40%)100 mL，以纯水定容至 1 000 mL，混匀后即可).

SPF级雄性ICR小鼠，5～6周龄，体重24～28 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，生产许可证号：SCXK(川)2015-030.

美洲大蠊提取物、白芨超微粉、石斛超微粉由云南中医药大学鉴定教研室杨竹雅教授鉴定并提供.

2 实验部分

2.1 均匀设计试验

按均匀设计原则选用U5(53)表，以美洲大螊提取物(X1)、白芨粉(X2)、石斛粉(X3)3种药物作为考察因子，每个因子分别取5个水平(即呈梯度递增的5种不同剂量).

根据美洲大螊提取物(临床推荐剂量为 0.5 g/次、3次/天)、白芨粉(临床常用推荐剂量为 3.0 g/天、3次/天)及石斛粉(临床常用推荐剂量为 3.0 g/天、3次/天)的临床使用剂量，得出小鼠的等效剂量分别为0.25、0.5、0.5 g/kg，并以此为基础确定美洲大螊提取物的小鼠剂量范围0.10～0.30 g/kg、白芨粉和石斛的剂量范围均为0.20～0.60 g/kg，从低到高各选取5个剂量水平.按照均匀设计表格安排各因子及水平，进行组方设计，得到均匀设计试验方案，见表1～3.

表1 均匀设计U5(53)表

表2 各因素剂量水平表 (g·kg-1)

表3 均匀设计试验方案 g

2.2 药效筛选试验

选用24～28 g 雄性ICR小鼠132只，按体重随机分为11组：正常对照；模型对照；阳性对照雷尼替丁 50 mg/kg；美洲大蠊提取物 0.25 g/kg(相当于混合物 1.56 g/kg)；白芨超微粉 0.5 g/kg；石斛超微粉 0.5 g/kg；不同剂量水平配比组方样品(实验1～5号)；每组12只.各组动物每日分别按剂量灌胃给药1次，连续7 d，正常和模型对照组给予纯水，容积均为 20 mL/kg.末次给药前禁食不禁水 24 h，末次给药后 1 h，除正常对照组外，各模型动物均按 0.1 mL/10 g 灌胃给予无水乙醇.造模 1 h 后，脱颈椎处死动物，剪开腹部，结扎幽门和贲门，并向胃内注射氯化钠注射液 2 mL，游离、并切下整个胃，置于10%中性福尔马林溶液中固定 10 min.取出，沿胃大剪弯开，平铺于玻片上，观察并按Guth计分标准[5]计算溃疡指数及溃疡抑制率.结果见表4及图1.

Guth计分标准：点状出血记1分；线状出血，若宽度<1 mm，糜烂长度<1 mm 记2 分，1～2 mm 记3分，2～3 mm 记4 分，>4 mm 记5分；若宽度>1 mm，以上分值×2.

溃疡抑制率=(模型组溃疡指数-给药组溃疡指数)/模型组溃疡指数×100%

由表4和图1可见，正常对照组小鼠禁食 24 h 后，胃粘膜完整，表面光滑，呈淡粉红色，无充血和溃疡等异常变化；与对照组相比，模型组小鼠胃粘膜有广泛损伤，呈暗红色，伴随有大量出血点或糜烂等，其溃疡指数明显增高(P<0.01)，表明造模成功.与模型组相比，各给药组小鼠胃粘膜出血和糜烂情况均有不同程度减轻，其中除美洲大蠊对溃疡指数的降低仅有作用趋势而无统计学差异外(P﹥0.05)，其余各给药组均能明显降低溃疡指数(P<0.05/0.01)，提示对无水乙醇致小鼠的急性溃疡有明显保护作用.

表4 对无水乙醇致小鼠胃溃疡的影响

图1 均匀设计试验小鼠胃粘膜损伤图示

2.3 对均匀设计试验结果进行优化分析

将以上药效学试验的结果(溃疡指数)分别输入计算机，采用DPS v8.01统计软件进行均匀设计回归分析，得出相关指标的回归方程和最优结果.见表5.

表5 3因素5水平均匀设计试验回归方程及结果

2.4 最佳配比

当美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的剂量配比为1.88∶0.6∶0.6 (g/kg)(试验中的5号样品)时，小鼠溃疡指数最低(1.6分)，与模型组相比溃疡抑制率为76.00%；由回归方程得出的最佳配比为0.625∶0.20∶0.20(g/kg)，溃疡指数为2.9分；2组剂量配比基本相当，均大致为3∶1∶1.由此，确定胃肠宁组方中美洲大蠊提取物(混合物)、白芨、石斛的最佳配比为3∶1∶1.

3 讨论

均匀设计法又称为均匀设计试验法或空间填充设计法，是一种可应用于各个领域的试验设计方法[10].以中医药传统理论为基点，将数理统计方法的理论与技术结合药理学实验对方剂的配伍规律进行研究，并通过对实验结果的统计分析与综合评价，可探讨复方中药味配伍与药理效应变化的相关规律，因此，均匀设计法近年来也被学者应用于复方剂量配伍优化的实验研究.该研究的关键点在于指标的选择，一般选取最为重要的 1～2 项指标，综合评估筛选出更优质的配伍处方后，再以此为基础进行后续的药学、药理、毒理等研究，同时要求最终筛选出的处方必须体现原处方的宗旨和立意，这样才能证明指标选择的正确性和准确性.

胃肠宁是云南省名中医吴生元教授的经验方，由美洲大蠊、白芨和铁皮石斛三味药组成，临床用于胃溃疡疗效显著.本研究采用均匀设计试验法，以美洲大蠊混合物、白芨及石斛超微粉为实验材料，在乙醇致小鼠急性胃溃疡模型上优化组方中三味药抑制溃疡指数的最佳配比，结果显示：美洲大蠊、白芨、石斛以3∶1∶1的剂量配比时，对无水乙醇致小鼠胃溃疡有最佳保护作用.