QuEChERS提取-EMR净化-高效液相色谱-串联质谱法快速测定养殖鱼中的乙氧基喹啉

陈琳珊 陈佩佩 何雯倩 陈茹

摘 要：建立了高效液相色谱-串联质谱法对养殖鱼中的乙氧基喹啉进行快速测定。基于QuEChERS技术，样品用乙腈和水提取，盐析分层离心。经增强型基质去除固相吸附剂（Enhanced Matrix Removal，EMR）净化后，通过电喷雾电离源（Electrospray Source Ionization，ESI）的正离子模式电离，结合多反应监测（Multiple Response Monitoring，MRM）进行采集。乙氧基喹啉标准曲线在1.0～200 μg/L范围内呈良好线性关系，相关系数r>0.999 6，平均回收率为82.9%～105.0%，方法检出限为10.0 μg/kg，方法定量限为30.0 μg/kg，相对标准偏差RSDs为4.64%～5.96%。该方法简单快捷，回收率良好、灵敏度高和重现性好，可应用于实际养殖鱼中乙氧基喹啉的快速测定。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱法;快速测定;水产品;乙氧基喹啉

乙氧基喹啉（Ethoxyquin，EQ）是一种经化学合成的芳香胺，结构如图1所示，呈油状液体，具有清除自由基从而防止脂质氧化的作用，同时对蛋白质、维生素等物质也有很好的抗氧化效果[1]，因此在饲料产品市场中应用广泛。有研究表明，一定量的乙氧基喹啉对大黄鱼、雏鸡具有一定的促生长作用，但过量时会产生抑制生长的作用[2-3]，同时，过量的乙氧基喹啉会对动物机体产生一定的不良影响，如400 mg/kg

的饲料添加量会使大菱鲆降低食量[4]，而15 000 mg/kg的添加量也会使大西洋鲑产生拒食现象[5]。按照欧盟规定，2018年3月31日后不允许饲料产品中有乙氧基喹啉产品添加，可见乙氧基喹啉的安全性确实存在一定的争议，而人类作为水产品的终端消费者，乙氧基喹啉在水产品中的残留量也会对人体存在一定的隐患。目前，我国的相关法律法规仍然允许乙氧基喹啉在饲料中添加使用，由于其效果优异，即使我国水产品行业禁用后，仍然有可能会存在一段时间的违法滥用。因此，建立水产品中乙氧基喹啉快速有效的检测方法具有极其重要的意义。

图1 乙氧基喹啉化学结构式

目前，对水产品中乙氧基喹啉测定方法的相关报道较少，主要为毛细管电泳法[6]、高效液相色谱法[7-9]、气相色谱法[10]、液相色谱串联质谱法[11]、气相色谱-质谱法[12]和高分辨质谱法[13]。毛细管电泳法灵敏度高、重现性差，高效液相色谱法和气相色谱法则存在选择性较低的问题，高分辨质谱法价格昂贵，仪器维护成本高，难以普及，因此这些方法均难以应用于实际的大批量检测。而液相色谱串联质谱法、气相色谱-质谱法则具有灵敏度高，选择性好，应用广泛的优点，可用于实际的批量检测。本文建立的高效液相色谱-串联质谱法，基于QuEChERS方法提取，增强型基质去除净化剂EMR进行净化，通过二次优化质谱参数，使目标物达到实际测定的最佳响应值，结合高效液相色谱，使目标物在短时间内出峰，且保持良好的峰型。同时方法学实验数据表明，该方法可有效测定水产品中的乙氧基喹啉。

1 材料与试剂

1.1 仪器与设备

高效液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾电离源（ESI）（API 4000Q，AB SCIEX公司）;电子天平;4k-15离心机（北京卓明贸易有限公司）;IKA Vortex4涡旋混匀器（广州仪科实验室技术有限公司）;Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。

1.2 材料与试剂

养殖鱼样品，购于广州市市场。

甲酸、乙腈（LC-MS级，美国Thermo Fisher公司）;乙氧基喹啉标准品（纯度≥98.5%，SIGMA，购自安谱公司）;EMR净化管（安捷伦，购自德祥公司）;石墨化炭黑键合硅胶（Graphitizing of Carbon Black，GCB）、十八烷基键合硅胶（C18）、N-丙基乙二胺键合硅胶（Primary Secondary Amine，PSA）（购自广州联方公司）;无水硫酸镁、氯化钠（分析纯，购自安谱公司）。

1.3 实验条件

1.3.1 标准溶液的配制

标准溶液：称取适量标准品，用乙腈溶解并配成浓度为1 mg/mL的标准储备溶液，于4 ℃下避光保存。

标准工作溶液：分别准确移取一定体积的标准储备液，用乙腈重新定容成1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L的标准工作液。

1.3.2 样品处理

养殖鱼产品先均质处理。称取均质后样品2.0 g（精确至0.01 g），精密称定于50 mL离心管中，先加入水10 mL，再加入乙腈10 mL，涡旋混合2 min，然后加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，涡旋提取15 min，10 000 r/min离心5 min，离心后取2 mL上清液转移至15 mL EMR脱脂净化管（预先用1 mL水活化2 min）中，涡旋2 min后，4 500 r/min离心5 min，取1.5 mL上清液于装有0.5 g无水硫酸镁的2 mL离心管中脱水后过膜上机。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Agilent poroshell EC-C18 （150 mm×3.0 mm，2.7 μm）;柱溫为40 ℃;进样量为10 μL;流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水（体积分数）;采用等度洗脱方式洗脱分离：A∶B为80∶20;流速为0.40 mL/min;采集时间：7 min。

1.3.4 质谱条件

离子源：电喷雾电离源（ESI）;电离模式：正离子模式;离子源温度为500 ℃，离子源电压为5 000 V。雾化气（GAS1）：50 psi;加热辅助气（GAS2）：50 psi;碰撞气（CAD）：medium;采集模式：多反应监测（MRM）模式。

2 结果与分析

2.1 质谱分析条件的确定

建立养殖鱼中乙氧基喹啉的仪器分析方法，通过流动注射的方式，将标准溶液直接注入ESI离子源，确定乙氧基喹啉的母离子质荷比为m/z 218.3，子离子质荷比分别为m/z 148.2和m/z 174.2，同时优化其去簇电压DP和碰撞能量CE，得到最佳的参数条件，见表1。通过优化色谱条件，确定最佳洗脱流动相比例为乙腈∶0.1%甲酸水（80∶20），流速为0.40 mL/min。乙氧基喹啉标准品提取离子流色谱图如图2所示。

2.2 分散固相萃取剂类型的选择

在实验初期，探究了分散固相萃取剂类型对乙氧基喹啉回收率的影响。由于购买的EMR净化管中包含了1.1 g的EMR净化粉末，为了保证方法的简便性，不再对用量进行探究，同时，用同样量的PSA、C18和GCB净化粉末进行回收率的对比。分别对每个用量水平重复测定6次，以平均回收率为考察依据。结果显示，当用EMR净化时，乙氧基喹啉的回收率最高。而且水产品中含有较多的油脂，用EMR净化能降低仪器分析时的基质效应。因此，最终选择EMR为净化剂。结果详见图3。

2.3 基质效应

养殖鱼中基质复杂，对目标物可能存在基质效应，从而影响目标物在质谱中的离子化程度，因此对乙氧基喹啉的基质效应（matrix effect，ME）进行了考察。按照前处理方法对乙氧基喹啉呈阴性的罗非鱼进行处理，得到空白基质液，用此空白基质液配制50 μg/L的单标溶液，按方法的仪器条件测试，测得值和原浓度比值即为ME，以ME作為判断的依据。当ME值在0.8～1.2时，基质效应不明显;若ME值小于0.8，则说明基质效应为强负效应明显，大于1.2则为强正效应。乙氧基喹啉的ME计算结果为0.92，说明基质效应不明显，这可能是由于EMR净化了样品中大部分的油脂。因此，为了简化实验，最终采用溶剂曲线作为定量曲线。

2.4 线性关系和检出限

在本方法所确定的实验条件下，用乙腈将标准溶液稀释至1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L和200.0 μg/L进行测定，以峰面积（Y轴）对相应的浓度（X轴）作图，得到线性方程Y=1.76×104X-3.92×103。结果表明，待测化合物浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系，相关系数r为0.999 6，具有较准确定量能力。

同时，通过对罗非鱼样品进行低浓度水平加标，再分别按信噪比的3倍（S/N=3）和10倍（S/N=10），得出方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果表明，乙氧基喹啉的方法检出限为10.0 μg/kg，定量限为30.0 μg/kg，表明方法具有较高的灵敏度。

2.5 回收率与精密度实验

选取均质后的样品初步平均测定3次，确定其本底值，再进行加标回收实验，结果见表3。最终选用乙氧基喹啉呈阴性的罗非鱼和黄鳝作为加标回收样品，按照乙氧基喹啉定量限的1倍、2倍和5倍水平进行添加，每一个水平均进行日内重复测定6次（n=6）。最终测得平均回收率在82.9%～105%，相对标准偏差RSD为4.64%～5.96%。结果表明，方法回收率良好，精密度好，满足实验室的测定要求。

3 结论

本文基于QuEChERS技术对样品进行提取，选用增强型基质去除EMR粉末进行分散固相萃取净化。建立的超高效液相色谱条件使目标物在3 min内出峰，且峰型良好。通过流动注射混合流动相的方式，二次优化目标物的质谱参数，提高了目标物的灵敏度。通过方法学实验验证了方法的可行性，结果表明，该方法回收率良好，灵敏度高，重复性好。在实际的样品测定实验中，能有效检测出实际阳性样品，因此，可应用于日常实验室的检测中，同时也为后续的相关研究提供了参考依据。

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