解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌、有益菌抑菌性能的研究初报

王政露，肖明霞，王乙茹，柳成东，赵 平，钱锦花，杨保和，屈 娥*，程志斌*

（1.云南农业大学，昆明 650201；2.达州职业技术学院，四川 达州 635001；3.玉溪农业职业技术学院，云南 玉溪 653100；4.云南快大多畜牧科技有限公司，云南 玉溪 653100）

2020年7月1日起，农业农村部颁布了禁止以促生长为目的的药物饲料添加剂的使用，因此微生态制剂等功能性“替抗”饲料添加剂的评估与应用技术受到畜牧行业的高度关注[1-4]。解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）归类于芽孢杆菌属细菌，由于对植物病原菌有较好的抑制作用，因此目前在农业种植业中广泛应用[5-7]。尽管解淀粉芽孢杆菌至今未进入我国饲料添加剂品种目录，但因其具有良好的耐热性，适合饲料制粒，近年来在畜禽养殖中的饲用价值评估逐步增多[8-10]。已有动物饲养试验显示，饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌显著提高了断奶仔猪、肉鸡的生长性能[9-12]；然而也有报道称饲用解淀粉芽孢杆菌没有明显改善猪鸡的生长性能[13-14]。以上饲养试验报道的矛盾提示：评估饲用微生态制剂对畜禽生产性能的饲养试验易受试验菌株、试验动物、养殖条件、试验设计等因素的干扰，试验结果重复性不稳定[15-16]，且动物饲养试验的周期较长、费用高。因此，建立体外科学、高效的实验室评估方法与技术，可能更有助于加快解淀粉芽孢杆菌作为饲用益生菌的潜在价值评估。

抑菌性能是饲用微生态制剂平衡畜禽肠道菌群、促进生产性能的重要机制之一[4]。因此，针对畜禽肠道主要有害菌及有益菌，采用体外抑菌试验技术评估解淀粉芽孢杆菌的抑菌性能，能够验证饲用解淀粉芽孢杆菌在畜禽体内发挥平衡肠道菌群、促进生长的确切效果。体外牛津杯法是微生态制剂抑菌作用的最常见评估方法之一[4]，已被用于解淀粉芽孢杆菌抑菌性能的评估[17-19]。然而，现有的报道集中在解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌的抑制研究[17-20]，对肠道有益菌抑制作用的报道较少[21]，显然这不利于全面评估解淀粉芽孢杆菌平衡肠道菌群、改善畜禽生产性能的作用。据此，本研究较为系统地开展了解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌及有益菌的抑菌作用评估，以期为解淀粉芽孢杆菌在畜禽生产中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 微生物及指示菌

从云南农业大学农作物种植基地分离出一株具有降解化学农药的解淀粉芽孢杆菌，经16S RNA鉴定为解淀粉芽孢杆菌并命名为YNAU 6172，用于本次抑菌试验评估。

试验用指示菌包括2 类6 个：（1）肠道有害菌：大肠杆菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大肠杆菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）；（2）肠道有益菌：罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜热双歧杆菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525）。以上菌株购买自北纳创联生物科技有限公司。

1.2 牛津杯抑菌试验

1.2.1 解淀粉芽孢杆菌及指示菌的培养

（1）LB培养基：酵母膏5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸馏水1 000 mL。用于培养解淀粉芽孢杆菌及指示菌大肠杆菌K88和大肠杆菌K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌；

（2）MRS培养基：酵母膏10.0 g、蛋白胨20.0 g、NaCl 2.5 g、葡萄糖20.0 g、番茄汁50 mL、磷酸氢二钾2.0 g、硫酸镁1.0 g、蒸馏水1 000 mL。用于培养指示菌罗伊氏乳酸杆菌；

（3）BBL 培养基：酵母膏2.0 g、蛋白胨15.0 g、NaCl 5.0 g、葡萄糖20.0 g、番茄粉5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、可溶性淀粉0.5 g、肝浸粉2.0 g、1 mL 吐温-80、蒸馏水1 000 mL。用于指示菌嗜热双歧杆菌的培养。

1.2.2 指示菌涂布平板制备

（1）指示菌大肠杆菌K88 和K99、猪霍乱沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌涂布平板采用LB 培养基，121 ℃灭菌30 min后，冷却至50 ℃左右倒入培养皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

（2）指示菌罗伊氏乳酸杆菌和嗜热双歧杆菌涂布平板采用MRS培养，121 ℃灭菌30 min后，冷却至50 ℃左右倒入培养皿（25～30 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

1.2.3 指示菌液稀释、涂布

（1）将培养24 h 的大肠杆菌K88 和大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的中菌液各吸取800 μL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管，进行梯度稀释至10-3，涂布。每次操作每个指示菌涂3个培养皿（即3次平行测定）。

（2）将培养24 h的罗伊氏乳酸杆菌吸取800 μL，转入装有7.2 mL 无菌水的EP 管中，进行梯度稀释至10-3，涂布。每次操作每个指示菌涂3 个培养皿（即3次平行测定）。

（3）将培养48 h的嗜热双歧杆菌吸取发酵原液进行涂布。每次操作每个指示菌涂3个培养皿（即3次平行测定）。

1.2.4 牛津杯抑菌圈直径测定

为了评估解淀粉芽孢杆菌对2 类6 个指示菌的抑菌效果，每个指示菌吸取200 μL 涂布一个培养皿，并在每个培养皿中放置1 个牛津杯，向牛津杯加入100 μL 培养24 h 的解淀粉芽孢杆菌菌液。放置恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径（Diameter of inhibition zone，DIZ）的最大值与最小值，以二者的平均值确定抑菌圈直径数据。

1.2.5 抑菌作用的判定方法

关于解淀粉芽孢杆菌抑菌作用，目前尚无统一的判定标准，本研究参考李静舒等[22]报道的方法，并依据所用牛津杯的直径（7.8 mm），将牛津杯外径约2 倍（16.0 mm）区分为敏感与高敏感。因此抑菌作用判定标准如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16 mm，高敏感。

1.3 数据分析

以上抑菌试验重复操作3次，抑菌圈直径数据采用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

测定解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制情况，结果见图1。结果显示解淀粉芽孢杆菌对指示菌大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌的抑制作用均判定为不敏感（DIZ=7.8 mm）。

图1 解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用情况

2.2 解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制作用

测定解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制情况，结果见图2。

图2 解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制情况

解淀粉芽孢杆菌对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用为敏感[DIZ=（11.7±0.6）mm]，对嗜热双歧杆菌的抑制作用判定为不敏感。

3 讨 论

3.1 解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

畜禽养殖过程中由于养殖卫生环境的差异，感染不同类型的肠道致病菌易引发腹泻等肠道疾病，造成一定的养殖经济损失。其中，大肠杆菌

K88[23-24]、大肠杆菌K99[23]、猪霍乱沙门氏菌[25]和鸡白痢沙门氏菌[26]是猪鸡肠道主要的有害致病菌。图1 显示，该株解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌等无抑制作用。M.P.Lisboa等[21]最早报道，解淀粉芽孢杆菌（菌株编号LBM5006）对大肠杆菌和沙门氏菌均无抑制作用。R.Scholz 等[17]研究表明，解淀粉芽孢杆菌（菌株编号FZB42）对大肠杆菌没有抑制作用。董靖等[27]研究也显示，解淀粉芽孢杆菌（菌株编号HE）对大肠杆菌没有抑制作用。以上3篇报道与本试验结果一致。此外，张彤等[28]和夏超笃等[19]通过牛津杯抑菌图片直观显示，解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用均为低敏感，这与本试验结果接近。

然而，付志英等[29]报道，解淀粉芽孢杆菌（菌株编号KHQH-1）对大肠杆菌的抑制作用达到高敏感（DIZ=16.0 mm）。T. Ndlovu 等[18]研究显示，解淀粉芽孢杆菌（菌株编号ST34)对大肠杆菌（DIZ=18.3 mm）和沙门氏菌（DIZ=25.3 mm）的抑制作用均为高敏感。以上报道与本试验结果之间差异主要原因可能是解淀粉芽孢杆菌菌株不同，这提示饲用解淀粉芽孢杆菌的研发需进一步筛选显著抑制畜禽肠道有害菌的优势菌株，才有助于推动解淀粉芽孢杆菌作为饲用益生菌进入我国饲料添加剂品种目录，为我国畜牧业替抗提供更多可选择的产品及技术方案。

3.2 解淀粉芽孢杆菌对肠道主要有益菌的抑制作用

乳酸杆菌和双歧杆菌是畜禽肠道优势主要有益菌，对维持畜禽肠道菌群平衡、肠道健康和良好生长性能有重要意义[30-31]。罗伊氏乳酸杆菌是畜禽肠道分布最广泛、比例最高的乳酸杆菌[31]，嗜热双歧杆菌是维持畜禽肠道菌群平衡的重要双歧杆菌之一[30]。目前，有关解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道有益菌的体外抑菌研究极少。唯一的1篇试验报道[21]显示，解淀粉芽孢杆菌对罗伊氏乳酸杆菌有一定的抑制作用（DIZ=9.8 mm），这与本试验结果基本一致。Teng P.Y.等[32]报道，饲粮添加解淀粉芽孢杆菌组的肉鸡盲肠和回肠乳酸杆菌数量，与基础饲粮组没有显著性差异。Cao G.T. 等[33]和 Hong Y.X.等[10]进一步试验表明，与基础饲粮组比，饲用解淀粉芽孢杆菌组肉鸡盲肠乳酸杆菌的数量显著降低。以上体内动物试验检测肠道菌群的数据与本研究及M.P.Lisboa等[21]体外抑菌试验结果基本相符。

然而，Lei X. J. 等[12]和杨敏馨[34]在肉鸡以及Li X.等[9]在断奶仔猪中的饲养试验均发现，饲粮添加解淀粉芽孢杆菌能够显著提高肠道乳酸杆菌数量。结合以上体外抑菌试验以及饲养试验肠道菌群报道的诸多矛盾，进一步提示：解淀粉芽孢杆菌菌株的差异可能造成体外及体内抑菌性能的不同，从而最终影响解淀粉芽孢杆菌的饲用价值。

4 结 论

本研究采用体外牛津杯法评估了一株解淀粉芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌、有益菌的抑制作用。研究显示，该株解淀粉芽孢杆菌对大肠杆菌K88 及K99、鸡白痢沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等主要肠道有害菌均无抑制作用，且对肠道有益菌罗伊氏乳酸杆菌有一定的抑制作用。以上结果提示，解淀粉芽孢杆菌作为饲用微生态制剂在畜禽饲粮中的开发需进一步筛选与谨慎验证饲喂效果。