红霉素对聚甲基丙烯酸甲酯磨损颗粒刺激下MC3T3-E1细胞成骨作用的影响

刘子歌，张 晨，宋国瑞，王 强，郭高鹏，陈德胜

人工关节无菌性松动是全关节置换术的主要并发症之一，其主要是由于体内破骨细胞和成骨细胞对磨损颗粒的生物学反应导致的。限制假体周围骨溶解的方法大多专注于抑制假体周围炎症和破骨细胞形成。最新的研究表明成骨细胞在这个过程中也发挥了重要的作用[1-3]。骨祖细胞和骨髓间充质干细胞都可以分化为成骨细胞，它们与假体周围磨损颗粒的相互作用对于人工假体的初始骨整合和假体周围骨的长期形成都是十分重要的。有研究表明，磨损颗粒还可以通过破坏骨祖细胞和间充质干细胞的成骨潜能来促进骨溶解[4]。由于骨重建依赖于成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收之间的平衡，抑制成骨细胞的产生可以使平衡向加速溶骨的方向倾斜。红霉素是一种十四元环大环内酯类抗生素，用于治疗感染性疾病已有50多年的历史，具有良好的抗炎作用。Kudoh等[5]在1998年就证明了红霉素可以用于弥漫性全细支气管炎的抗炎治疗。还有研究表明，红霉素通过抑制NF-κB信号转导通路而发挥抗炎作用[6]。本课题组的前期研究显示NF-κB在磨损颗粒诱导的炎性骨溶解中有重要作用，鉴此认为红霉素是治疗人工关节置换术后假体无菌性松动的潜在候选药物[7]。本研究旨在探讨红霉素对聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate,PMMA)磨损颗粒刺激下MC3T3-E1细胞成骨作用的影响及其潜在的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验材料 MC3T3-E1细胞，由中南大学湘雅医院运动系统损伤与修复研究中心赠送。PMMA磨损颗粒，由日本岛根大学附属医院矫形外科赠送，直径均<10 μm，按本课题组的前期方法进行处理并检测内毒素，确保能用于后续实验[8]。α-MEM培养基、DMSO、胎牛血清购自美国Gbico公司。红霉素购自美国MCE公司，纯度>99.00%。β-甘油磷酸钠(sodium β-glycerophosphate)、L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)购自美国Apexbio公司。鲎内毒素检测试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司。乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒购自上海碧云天生物技术公司。Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA反转录试剂盒、Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara生物公司。

1.2成骨细胞培养及分组方法 取MC3T3-E1细胞解冻复苏，离心弃上层冻存液，以含有10%胎牛血清、1%青链霉素的α-MEM培养基进行重悬，于培养箱中进行细胞培养(37 ℃、5% CO2)，培养基成分为含10%胎牛血清、1%青链霉素的α-MEM培养基+10 mM β-甘油磷酸钠+50 μg/ml L-抗坏血酸。在添加PMMA磨损颗粒(1 mg/ml)之前，采用不同浓度(0.0 μg/ml、0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml)的红霉素对MC3T3-E1细胞进行预处理2 h；以未经PMMA和红霉素处理的MC3T3-E1细胞作为空白对照组。每个处理组做3个复孔，每3 d更换细胞培养基。

1.3MC3T3-E1细胞增殖活性检测方法 应用乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒对MC3T3-E1细胞的乳酸脱氢酶进行检测，以反映细胞增殖活性。收集经PMMA磨损颗粒(1 mg/ml)与不同浓度红霉素干预组处理72 h后的上清培养液，各组取100 μl培养基至96孔板中，与100 μl的工作溶液混合，避光室温孵育30 min。采用E2500全波长自动酶标仪检测各孔490 nm的吸光度值。细胞增殖活性(%)=(干预组吸光度-空白对照组吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-空白对照组吸光度)×100%。

1.4MC3T3-E1细胞成骨活性检测方法 应用碱性磷酸酶检测试剂盒对MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶进行检测，以反映细胞成骨活性。按照分组处理细胞，MC3T3-E1细胞在培养基中培养72 h后，以4 ℃磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)轻轻冲洗2遍，RIPA裂解细胞，离心，收集细胞裂解蛋白产物。严格按照试剂盒说明书配置标准样品，设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，在37 ℃生物孵育箱中孵育30 min。每孔加入100 μl终止液，使用E2500全波长自动酶标仪检测各孔405 nm的吸光度值。

1.5实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)检测方法 按照分组处理细胞，MC3T3-E1细胞在成骨培养基中培养72 h后，采用Trizol法提取细胞总RNA，应用Prime Script RT reagent Kit Perfect Real Time RNA试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。应用Ultra SYBR One Step RNA PCR Kit荧光定量PCR试剂盒进行RT-PCR，测定目的基因的转录水平，所用引物由上海生工生物科技有限公司设计并合成，序列见表1。以2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量。

表1 引物序列

2 结果

2.1各处理组MC3T3-E1细胞增殖活性比较 与空白对照组比较，其他处理组MC3T3-E1细胞增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)，说明本实验所设置红霉素和PMMA颗粒浓度条件对MC3T3-E1细胞的增殖活性没有造成影响。见图1。

图1 各处理组MC3T3-E1细胞增殖活性图

2.2各处理组MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶浓度比较 与空白对照组相比，经PMMA处理组的细胞碱性磷酸酶浓度均显著降低(P<0.05)。而加入浓度为0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml、10.0 μg/ml红霉素进行干预后，细胞碱性磷酸酶浓度升高，呈剂量依赖性，且PMMA+1.0 μg/ml红霉素组、PMMA+5.0 μg/ml红霉素组、PMMA+10.0 μg/ml红霉素组的细胞碱性磷酸酶浓度均显著高于PMMA组(P<0.05)。见图2。

与空白对照组比较，#P<0.05；与PMMA组比较，*P<0.05图2 各处理组MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶浓度比较图

2.3各处理组MC3T3-E1细胞成骨基因表达水平比较 与空白对照组相比，PMMA组Runx2、Osterix、OCN的表达水平均显著降低(P<0.05)，而p65表达水平显著增高(P<0.05)。经0.2 μg/ml、1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml红霉素处理后，MC3T3-E1细胞p65表达水平较PMMA组显著降低(P<0.05)。经1.0 μg/ml、5.0 μg/ml和10.0 μg/ml红霉素处理后，MC3T3-E1细胞Runx2、OCN表达水平较PMMA组显著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml红霉素处理后MC3T3-E1细胞Runx2、OCN表达水平与PMMA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。经5.0 μg/ml和10.0 μg/ml红霉素处理后，MC3T3-E1细胞Osterix表达水平较PMMA组显著上升(P<0.05)，而0.2 μg/ml、1.0 μg/ml红霉素处理后MC3T3-E1细胞Osterix表达水平与PMMA组比较差异无统计学意义(P>0.05)。红霉素干预对Runx2、Osterix、OCN和p65表达水平的恢复均呈剂量依赖性。见表2。

表2 各处理组MC3T3-E1细胞成骨基因表达水平比较

3 讨论

3.1人体内骨转换是由破骨细胞性骨吸收和成骨细胞性骨形成之间的微妙平衡决定的。虽然激活的巨噬细胞和活化的破骨细胞是假体周围骨溶解中骨破坏的主要因素，但磨损颗粒对成骨细胞的影响也会显著降低假体界面处的骨形成。有研究表明，磨损颗粒还会影响骨祖细胞的增殖、成熟和分化，通过减少骨形成促进骨溶解过程[9]。许多类型的人工关节假体磨损颗粒会对成骨细胞的活性、增殖能力和功能产生影响，如钛颗粒、超高分子量聚乙烯、陶瓷颗粒和PMMA磨损颗粒等[10-11]。本研究结果提示，红霉素干预处理后可显著降低PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞骨生成的抑制作用。

3.2Chiu等[12]报道PMMA磨损颗粒可抑制MC3T3-E1细胞的碱性磷酸酶活性，且呈剂量依赖性。本研究结果也显示，1 mg/ml的PMMA磨损颗粒即可对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶的浓度产生明显的抑制作用，而红霉素干预可减轻PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶造成的影响。OCN是成骨细胞终末分化的标志物[13]。本研究结果提示红霉素对PMMA磨损颗粒诱导的OCN基因表达下调有一定的缓解作用。另外，成骨细胞分化还受到转录因子Runx2和Osterix的调控[14-15]。Runx2可调节成骨细胞关键蛋白的表达，如碱性磷酸酶和OCN。在成熟的成骨细胞中，Osterix位于Runx2的下游。本研究发现红霉素干预可改善PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞造成的Runx2和Osterix表达下调。然而PMMA磨损颗粒对成骨细胞的作用机制尚不十分清楚。

3.3目前，已有许多研究证实了NF-κB信号通路对破骨细胞形成的作用，但其对成骨细胞和骨形成的作用仍不明确[16-19]。本研究结果显示，PMMA磨损颗粒干预可显著增加MC3T3-E1细胞NF-κB信号通路中p65的表达。PMMA磨损颗粒诱导NF-κB信号通路活化的机制可能是多因素的。本研究发现，0.2 μg/ml的红霉素即可改善PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞的刺激作用，降低p65的表达水平。因此推测红霉素是通过抑制NF-κB信号通路而缓解PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞Runx2和Osterix的下调作用，从而部分恢复碱性磷酸酶浓度。NF-κB信号通路激活与慢性炎症、自身疾病以及癌症密切相关[20]。笔者认为红霉素的抗炎作用可以在一定程度上减少炎症细胞因子对成骨细胞和成骨细胞前体的抑制作用，这部分是通过抑制NF-κB信号通路的激活来实现的。但是需要更多的实验证明成骨细胞和成骨细胞前体中NF-κB信号转导与Runx2信号转导之间的相互作用。

综上所述，红霉素干预可减轻PMMA磨损颗粒对MC3T3-E1细胞分化的抑制作用，其作用机制可能是通过抑制NF-κB信号通路来实现的。但是对于其他类型的磨损颗粒，红霉素是否依然能够展现出相似的作用仍有待进一步研究。红霉素可能是改善骨水泥相关假体的骨溶解和无菌性松动的一种潜在治疗药物。