广谱筛查常见呼吸道病原体方法的建立

姚燕丽 韩芝斌 吴静标 黄宇哲 张润锋 广东省医疗器械质量监督检验所 （广东 广州 510663）

内容提要：目的：实现常见呼吸道病原体的准确和广谱检测。方法：基于多重探针扩增技术（MPA）评估了该病原体分型检测试剂盒的准确度、灵敏度、特异性和重复性，并测试了413例临床样本。结果：乙型流感病毒、冠状病毒、腺病毒、人偏肺病毒、博卡病毒的检测灵敏度均为100%，甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、肺炎支原体的灵敏度均高于85.71%。甲型流感病毒、乙型流感病毒、冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体的检测特异度均为100%，呼吸道合胞病毒、鼻病毒、人偏肺病毒、博卡病毒的检测特异度均高于95.40%。结论：该检测试剂盒准确性、特异性和灵敏度较高，可重复性好，有希望应用于临床检测中，提高对患者的分流管理。

呼吸道病原体感染是临床较为常见的感染性疾病，致病病原体有流感病毒A（IFA）、流感病毒B（IFB）、副流感病毒（PIV）、呼吸道合胞病毒（RSV）、冠状病毒（HCoV）、腺病毒（ADV）、人鼻病毒（HRV）、人博卡病毒（HBoV）、人偏肺病毒（HMPV）、肺炎支原体（MP）、肺炎衣原体（CP）等。引起下呼吸道感染在全球病死率和发病率均保持高位，严重威胁着人类健康[1-3]。当下新型冠状病毒全球大流行，已成为影响全球的严重公共卫生事件[4-6]。疫情发生后，以核酸检测为基础的分子诊断产品为临床诊断提供了非常大的便利，并成为确诊的金标准之一。呼吸道感染确诊患者中存在一定比例的混合感染情况可能加重患者的病情，影响患者的诊断和治疗。当下呼吸道病毒核酸检测试剂多为单一检测，难以发现和鉴别临床感染症状相似的其他呼吸道感染病原体，无法快速诊断鉴别混合感染。因此，临床迫切需要新的方法对致病病原体进行更精准、更广谱的筛查。

新型的多重探针扩增（MPA）技术，采用双荧光探针设计原理：MPA检测探针（THO）和部分互补杂交探针（PCO），将TaqMan探针技术和熔解曲线技术相结合，每个靶标的THO/PCO混合物都有一个独特的熔解曲线和特征峰型（见图1）。当样品中存在目标物，则相应的THO探针被水解消耗，随即产生扩增曲线，同时通过比对阴性质控品的熔解曲线特征谱，则可根据相应的熔解曲线峰型特征谱判断样品中存在的靶标类型，从而对样品中的目标物进行特定检测。该技术充分利用4个荧光通道（FAM、VIC、ROX、CY5），成功突破了单通道单靶标的检测限制，实现了单通道多靶标的检测，单通道检测可多达4～10种靶标。

图1.MPA技术的双探针设计和特征性熔解曲线[7]

本文重点探讨基于MPA技术的呼吸道17项病原体分型检测试剂盒的建立和评估，及其广谱筛查常见呼吸道病原体的临床价值。该试剂盒可快速实现对常见呼吸道病毒及不典型病原体感染者的分流管理，并识别呼吸道病原体的单一感染和复合感染，有助于临床医师调整治疗方案，减少多次采样检测，有助于全球的疫情防控和病原体流行性调查。

1.材料与方法

1.1 引物探针设计

采用专业的软件设计，并使用NCBI-Blast工具检索引物与目的片段的特异性。

1.2 企业参考品组成和来源

企业阴性参考品由N1-N4（2ng/μL）组成，企业阳性参考品由P1-P11（104copies/μL）组成，企业最低检测限参考品由L1-L11（102copies/μL）组成，为P1-P12稀释得到，企业精密度参考品由R1-R3（103copies/μL）组成。所有的标准株、临床样本及其核酸样本来源于广东省第二人民医院和广东省中医院，由广州市宝创生物技术有限公司进行测序量值和制备。

具体组分如下：N1：肺炎链球、嗜肺军团菌；N2：大肠埃希氏、金黄色葡萄球菌；N3：肺炎克雷伯、流感嗜血杆菌；N4：阴性临床标本；P1：甲型流感病毒、人腺病毒临床标本；P2：人偏肺病毒临床标本；P3：副流感病毒1型、冠状病毒229E临床标本；P4：副流感病毒2型、冠状病毒HKU1临床标本；P5：副流感病毒3型、冠状病毒NL63临床标本；P6：副流感病毒4型、冠状病毒OC43临床标本；P7：乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒临床标本；P8：人鼻病毒临床标本；P9：人博卡病毒临床标本；P10：肺炎衣原体临床标本；P11：肺炎支原体临床标本；R1：甲型流感病毒、人腺病毒、人博卡病毒临床标本；R2：副流感病毒3型、冠状病毒NL63、肺炎支原体；R3：乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒。

1.3 临床样本的来源

收集2019年12月～2020年03月具有呼吸道感染症状或体征患者的鼻拭子3例、鼻咽拭子样本275例、痰液样本73例、肺泡灌洗液样本52例、肛拭子样本7例和粪便样本3例，总共413例样本。临床样本均来自武汉大学人民医院，患者对样本用途充分知情。

1.4 仪器与试剂

引物探针由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和修饰，One-Step RT-qPCR Kit购自NEB公司，PIV1和HCoV229E的假病毒颗粒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，HiPure病毒RNA/DNA提取试剂盒购自Qiagen公司，ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.5 方法

1.5.1 核酸提取。严格按照HiPure病毒RNA/DNA提取试剂盒说明书进行样本的提取，提取后的核酸样本置于-70°C冰箱保存。

1.5.2 PCR反应。根据所需测试的样本数，按照Luna Universal Probe One-Step Reaction Mix(2X) 10μL/测试、Luna WarmStart®RT Enzyme Mix(20X) 1μL/测试、Primer/Probe 1/2 1μL/测试、Nuclease-free Water 3μL/测试、RNA模板5μL/测试进行反应体系配制。扩增的参数和程序逆转录：55°C，10min；热启动：95°C，3min，95°C，10s；扩增：60°C，45s，69°C，20s，46个循环数，60°C收集信号；熔解曲线分析：25°C，1min，25～68°C，Continuous，升温过程收集信号，升温速率选择1%。

2.结果

2.1 准确度、特异性与灵敏度测试

为了评估该试剂盒的准确性、特异性和灵敏度，考察了企业参考品P1-P11、N1-N4和L1-L11。实验结果表明：P1-P11均为相应的靶标阳性，N1-N4均为阴性，L1-L11均为相应的靶标阳性，阳性样本的检测结果具有典型的“S”型扩增曲线及阳性特征峰型，说明该联检试剂盒的准确性、特异性和灵敏度高，无非特异扩增和交叉干扰现象。

2.2 精密度测试

为了评估该试剂盒的检测精密度性能，针对每个荧光通道的靶标选了3种企业精密度参考品（R1-R3），使用3批连续生产的试剂盒进行检测，每批次试剂盒对每种精密度参考品重复检测10次。计算批间精密度和批内精密度的变异系数（CV）。实验结果表明：批间精密度和批内精密度的变异系数均小于5%，说明该试剂盒的重复性良好。

2.3 临床样本的检测

为了评估该试剂盒的临床价值，使用该试剂盒对413例样本进行检测，以临床诊断信息为金标准，进行对比分析。实验结果表明：IFB、HCoV、ADV、HMPV、HBoV的检测灵敏度均为100%，IFA、RSV、HRV、MP的灵敏度均>85.71%。IFA、IFB、HCoV、ADV、MP的检测特异度均为100%，RSV、HRV、HMPV、HBoV的检测特异度均>95.40%。

2.4 临床样本的复合感染情况

在413例临床样本中，阳性样本有247例，阴性样本有166例，阳性样本中复合感染的比例为9.31%（23/247），其中双重感染所占比例为82.61%（19/23），三重感染13.04%（3/23），五重感染4.35%（1/23）。

3.讨论

呼吸道传染病病原体的复合感染在临床上比较常见，有效区分病原体感染类型才能为临床治疗提供精准的辅助证据，才能实现对患者的精准治疗和早期用药[8,9]。

本研究的呼吸道病原体分型检测试剂盒，可在单次反应中完成17种呼吸道常见病毒及非典型病原体的鉴别检测。MPA多重荧光PCR检测技术是基于目前医院常用的荧光PCR设备而开发的，可更高效地利用医院现有资源，无需昂贵、专一的仪器设备，无需荧光PCR设备高分辨率熔解曲线的温控要求，全程闭管检测，无需开管盖，避免实验室污染。本试剂盒在临床预评估实验中，检测了各种样本类型，包括鼻拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、肛拭子和粪便等。通过临床样本的检测数据统计，各病原体检测灵敏度普遍高于95%，最低也有85.71%，阳性样本中复合感染的比例为9.31%（23/247），其中双重感染所占比例为82.61%（19/23），三重感染13.04%（3/23），五重感染4.35%（1/23），以上数据说明本试剂盒的符合率高，检测的样本类型覆盖范围广，复合感染检出能力强，具有非常好的临床应用价值。

基于该技术的检测试剂盒具有操作简便、低成本的优势，同时，亦可实现试剂干粉化运输及检测结果自动化判读。临床数据显示，本研究中所建立的呼吸道17项病原体核酸分型检测试剂盒有非常大的临床应用价值，可有效地解决当下流感与新冠肺炎的快速鉴别检测问题，提高呼吸道传染病中的复合感染病例的阳性检出率，其自动化的判读软件既解决判读时效性的问题，又提高实验结果的准确性，能有效减少操作员主观带入的判读误差，得到准确的病原体感染信息，给临床治疗提供有效的参考依据，避免医疗资源的浪费。