piR-2878在神经胶质瘤组织中的表达及临床病理意义*

浦志一 张恒柱 戚庭月 王成海

1 扬州大学临床医学院神经外科，江苏省扬州市 225001; 2 扬州大学附属医院超声科; 3 扬州大学医学院病理学教研室

脑的神经胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，占颅脑肿瘤的40%～50%，是由先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致的[1-2]。piRNAs是与PIWI蛋白相互作用的核糖核酸，属于一类非编码蛋白RNA，其核苷酸序列有24～31个[3]。近年来piRNAs的功能研究已成为研究肿瘤的热点之一,piR-2878是piRNAs其中的一员。本研究采用RNA原位分子杂交技术检测piR-2878在胶质瘤组织及正常脑组织中的表达情况，运用统计学分析piR-2878表达水平与神经胶质瘤病理参数的相关性,并探讨其临床病理意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2018年1月—2020 年10月扬州大学附属医院(扬州大学附属苏北人民医院和扬州大学附属医院)神经外科手术的87例经病理医师证实的胶质瘤标本，35例正常脑组织来源于颅脑损伤后切除和尸体解剖的脑组织。患者年龄范围9～76 岁，中位年龄为 49岁; 男56例，女31例。标本使用及临床资料的收集均经扬州大学附属医院伦理委员会批准，并与患者签署知情同意书。

1.2 RNA原位分子杂交(RISH)实验及HE染色 piR-2878探针和原位杂交试剂盒购买于武汉BOSTER生物工程有限公司。主要的实验过程参考相关文献[4]，实验步骤大致如下：将切片脱去石蜡至水。使用胃蛋白酶进行消化。预杂交后使用piR-2878 RNA探针进行杂交，滴加一抗后滴加二抗，最后使用DAB显色呈棕黄色，胞核复染成蓝色，透明封片，光镜下观察。染色结果判定:细胞中出现棕黄色颗粒或团块为piR-2878阳性细胞；光镜下随机选择10个高倍视野,计算阳性细胞与总细胞数的百分率，<5%为低表达阳性组，5%～100%为高表达阳性组。分组包括正常脑组织(对照组)，胶质瘤空白对照组(不加一抗)，胶质瘤实验组。 HE染色主要过程：标本脱蜡至水；苏木素染料染细胞核；伊红液染胞质；脱水封片；光学显微镜下镜检，采集图像分析。

1.3 统计学方法 运用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料的统计运用均数±标准差及独立样本t检验；用χ2检验分析计数资料；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，用 Log-rank 检验P<0.05表示两组间差异有统计学意义，P<0.01表示两组间差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 神经胶质瘤组织常规染色 常规HE染色，经脱水、包埋、切片和苏木素伊红染色后，光学显微镜下可见，细胞浆为红色，疏松状；细胞核呈蓝色。肿瘤级别越高，核浆比例越小，肿瘤异型性也越明显，高胶质瘤组织中可见病理性核分裂象和瘤巨细胞，见图1。

图1 神经胶质瘤的常规HE染色(10×20)

2.2 原位杂交检测piR-2878在胶质瘤组织中的表达情况 RISH实验结果表明，87例胶质瘤组织中piR-2878 RNA的阳性染色为棕黄色，大小不等、染色深浅不同的颗粒或团块，主要定位于细胞浆中；正常脑组织中棕黄色颗粒极少，此为阴性或弱阳性表达，见图2。胶质瘤piR-2878阳性例数为79.31 % (69/87)；阳性百分比值为(81.2±1.3)%，明显高于正常脑组织的(5.0±0.7)%，两组间差异有统计学意义(t=36.036，P<0.05)。

图2 piR-2878在胶质瘤组织中的表达情况(10×20)

2.3 piR-2878在胶质瘤组织中的表达及临床意义 对87例神经胶质瘤患者的临床资料进行整理，重点统计分析piR-2878 RNA表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤级别、淋巴结转移和TNM分期之间的相关性。首先将piR-2878表达水平分为两组：低表达组和高表达组，分组依据是低表达组为阳性率≤5%，高表达组为阳性率5%～100%。统计结果显示高表达的piR-2878与肿瘤级别、局部浸润、复发明显相关(P<0.05)，而与患者的年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小均无关联(P>0.05)，见表1。

表1 piR-2878在胶质瘤组织中的表达及其临床意义

2.4 piR-2878表达水平与胶质瘤患者生存预后的关系 高表达组中位生存时间(OS)为19个月(四分位区间 5～33个月)，低表达组中位OS为48个月(四分位区间22～71个月)。低表达组OS均明显长于高表达组(P<0.05)，见图3。

图3 piR-2878 RNA表达水平与胶质瘤患者预后的生存曲线图

3 讨论

神经胶质瘤是脑部常见的肿瘤。在WHO病理学分级上，根据肿瘤的恶性程度分为两类4个级别：低级别胶质瘤(WHOⅠ～Ⅱ级)，为分化良好和预后佳的胶质瘤；高级别胶质瘤(WHO Ⅲ～Ⅳ级)，为低分化胶质瘤，患者预后不佳[5-7]。肿瘤好发的部位以小脑幕为界分为幕上胶质瘤和幕下胶质瘤。经过手术、放疗和化疗等综合治疗后Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤患者的生存期在8～10年之间，而Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤患者的生存期在1～3年不等[8]。胶质瘤与正常脑组织分界不清，手术很难全部切除，往往会导致肿瘤复发，最终引起患者预后不良而死亡。因此寻找新的胶质瘤诊断方法、治疗方案、转移复发监测指标及预后判断指标尤为紧迫。

piRNA是一种核苷酸数量小(20～30个)的非编码蛋白RNA，与PIWI蛋白结合发挥相应的生物学功能[9-10]。初始的研究表明piRNA在男性生殖细胞的功能包括调节精子的表观遗传和维持生殖干细胞[3]。目前，piRNA影响恶性肿瘤发生发展的过程已成为研究肿瘤的新热点，许多piRNAs在恶性肿瘤组织中表达异常，并对癌症细胞的增殖、凋亡和侵袭迁移有促进或抑制作用[11-14]。例如，郭玉莲等人[15]研究表明在食管鳞状细胞癌组piRNA-19166的表达水平下降，低表达的piR-19166与肿瘤的分化程度、淋巴结转移和 TNM 分期密切相关,提示piR-19166是食管癌的一种新肿瘤抑制基因，而Qi T等人[16]结果提示piR-19166靶向前列腺癌细胞的CTTN基因，得以抑制癌细胞浸润和远处转移，其为前列腺癌早期诊断和治疗的新标志物。在多发性骨髓瘤细胞中piR-823以外泌体囊泡的形式发挥生物学作用，为运用piRNA进行预后评估提供理论基础[17]。在大肠癌细胞中，piR-54265通过激活 STAT3 信号通路促进肿瘤细胞的生长和淋巴结转移以及增加抗药性，提示患者的预后不良[18]。在乳腺癌中piR-36712的表达水平越低，则患者的生存时间越短，这与乳腺癌细胞的广泛增殖并出现远处转移有关[19]。另外也有研究者通过piRNA 芯片技术在胃癌组织中鉴定出许多与胃癌相关的piRNAs，因此得出piRNA 参与了胃癌的发生发展过程[20]。目前，还没有文献报道piR-2878在神经胶质瘤中的表达情况，其生物学活性尚未明了，这也是本课题的研究目的所在。

本文通过RISH实验得出在胶质瘤组织中piR-2878呈阳性表达，而在正常脑组织呈阴性表达，提示piR-2878可能是一种新的胶质瘤促癌基因，其激活后促进胶质瘤的发生发展。同时我们分析了piR-2878在胶质瘤组织中的阳性表达与患者临床病理参数的关联性，本实验研究结果表明高表达的piR-2878与胶质瘤组织的肿瘤级别、淋巴结转移和TNM分期密切相关，说明强阳性表达piR-2878的胶质瘤肿瘤级别高，恶性程度高，患者的预后不好，这类肿瘤更容易从原发病灶向周围组织浸润生长，并向邻近的淋巴结转移和远处转移。在piR-2878表达水平与胶质瘤病人生存预后的关系统计中，低表达piR-2878的胶质瘤患者存活时间明显长于高表达piR-2878的患者，这也进一步说明piR-2878可以成为胶质瘤患者预后判定的一个重要指标。至于强阳性表达piR-2878的胶质瘤细胞有没有抗药性，目前还没有实验数据，有待于进一步实验证实，如有抗药性，则患者的生存时间短，死亡率高。

综上所述， piR-2878可能作为神经胶质瘤形成和患者预后判断的一种新肿瘤标志物。本实验探讨piR-2878在胶质瘤中的表达情况及其临床病理意义，为进一步研究其相关性功能提供理论依据，也为胶质瘤的诊断和治疗提供新的临床策略。