酪氨酸激酶受体EphA1调控Snail2蛋白影响胶质瘤细胞的侵袭能力

宋世宾，仇文进，肖祖沐，魏入廷，侯雨男，徐卡娅，陈益民

胶质瘤是成人最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤，尽管在包括外科切除、术后放化疗的标准治疗方面取得了一定进展，但胶质瘤患者的预后仍然很差[1]。胶质瘤的侵袭性是治疗的主要障碍[2-3]，其侵袭的机制仍不清楚。酪氨酸蛋白激酶受体(receptor tyrosine kinase)能够促进肿瘤的侵袭能力[4]，促红细胞生成素产生肝细胞受体(erythropoietin producing hepatoma cell line，Eph)家族是酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的家族[5]。EphA1作为Eph家族中的一员在多种恶性肿瘤的侵袭及进展中发挥重要作用[6-7]，但EphA1是否在胶质瘤进程中发挥作用鲜有报道。本研究旨在探讨酪氨酸蛋白激酶受体EphA1对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

正常星形胶质细胞NHA获赠于北京神经外科研究所，人脑胶质瘤细胞系U87、U251购买于美国模式培养细胞保育中心(ATCC)，DMEM高糖培养基、胎牛血清购买于美国Gibco公司，RNA提取试剂Trizol Regent购买于Ambion公司，转染试剂Lipofectamine2000购买于上海吉凯生物公司，兔抗人单克隆抗体一抗EphA1、Snail2、β-actin购买于美国CST公司，辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购买于北京中山金桥公司，EphA1小干扰(EphA1-siRNA)购买于上海吉玛生物公司，EphA1及GAPDH引物合成于上海生工生物公司，蛋白提取试剂盒及Western Blot 凝胶配制试剂盒购买于上海碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组和转染

正常星形胶质细胞NHA、胶质瘤细胞系U87、U251培养，置于含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基培养,培养箱设置为37 ℃、5%CO2,每隔2～3 d传代1次。细胞分组:阴性对照组 (转染无意义RNA序列) 和实验转染组 (转染EphA1小干扰RNA) 。按照上海吉凯生物公司说明书的方法在U87、U251细胞中进行EphA1的小干扰RNA和无意义序列的转染。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qPCR)检测

Trizol试剂提取细胞中总RNA，分光光度计检测RNA的浓度和质量，逆转录mRNA 为cDNA，逆转录后加入EphA1及内参GAPDH引物，EphA1上游引物5’-ATGGCACATACGAAACCC-3’，下游引物5’-ACCTCCCACATCACAATC-3’；GAPDH上游引物：5’-TCGACAGTCAGCCGCCGCATCT-3’，下游引物：5’-CCGTTGACTCCGACCTTCA-3’。设置qPCR反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃退火15 s，60 ℃延伸1 min，40个循环,最后72 ℃延伸5 min。并按照2-ΔΔCt方法计算RNA的相对表达量。

1.2.3 细胞划痕损伤修复实验

每个细胞培养小皿中种植3×105个细胞，移液枪头尖端在培养皿细胞层划痕，PBS冲洗3 次，加入无血清培养基。将培养皿放置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，分别于0、48 h拍照取样，计算划痕修复情况。

1.2.4 Western Blot实验

提取细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白浓度并加入上样缓冲液煮沸10 min，配制10% SDS-PAGE凝胶，每凝胶孔上样40 μg 蛋白，80 V电泳分离蛋白，恒流300 mA、100 min湿转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭PVDF 膜2 h，4 ℃一抗孵育过夜，常温二抗孵育2 h，最后化学发光法曝光显影。

1.2.5 统计学分析

2 结果

2.1 EphA1在胶质瘤细胞中表达水平高于正常星形胶质细胞

为明确EphA1在正常星形胶质细胞(NHA)与胶质瘤细胞U87、U251中的表达水平，通过qPCR实验检测正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞U87、U251中EphA1的mRNA表达水平，发现胶质瘤细胞U87、U251中EphA1的mRNA表达水平高于正常星形胶质细胞(图1A，P<0.05)；通过Western Blot实验检测正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞U87、U251中EphA1的蛋白表达水平，发现胶质瘤细胞U87、U251中EphA1 蛋白表达水平高于正常星形胶质细胞(图1B，P<0.05)。

图1 正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞中EphA1的mRNA、蛋白表达水平。A：qPCR发现U87及U251细胞中EphA1的mRNA表达高于NHA细胞,**P<0.01 (n=3)，***P<0.001 (n=3)；B：Western Blot发现U87及U251细胞中EphA1的蛋白表达高于NHA细胞。

2.2 敲低EphA1可抑制胶质瘤细胞的侵袭能力

在胶质瘤细胞U87和U251中转染EphA1小干扰RNA作为实验转染组，并以转染无意义序列RNA作为阴性对照组，通过细胞划痕损伤修复实验评估敲低EphA1后对胶质瘤细胞侵袭能力的影响。与阴性对照组比较，转染EphA1小干扰RNA后胶质瘤细胞U87(图2A见封二，P<0.001)和U251(图2B见封二，P<0.001)的细胞划痕损伤48 h后修复能力明显减弱，说明敲低EphA1表达后胶质瘤细胞侵袭能力减弱。

2.3EphA1调控Snail2蛋白表达影响胶质瘤细胞的侵袭能力此外，通过Western Blot实验检测在胶质瘤细胞U87和U251中敲低EphA1表达对上皮间质转化(EMT)标记蛋白的影响。与阴性对照组相比，在胶质瘤细胞U87和U251中转染EphA1小干扰RNA后，EphA1蛋白表达水平显著降低，敲低EphA1表达抑制了EMT标记蛋白Snail2表达水平(图3见封二，P<0.05)。上述实验表明EphA1小干扰RNA的敲低效果，并证实EphA1可能通过调控Snail2蛋白表达促进胶质瘤细胞发生EMT，从而影响胶质瘤细胞的侵袭能力。

3 讨论

胶质瘤是成人中枢神经系统中常见的恶性肿瘤，尽管目前针对胶质瘤的治疗采取了手术切除肿瘤组织、术后辅助以放疗化疗方法，但是胶质瘤患者的预后依然不佳，尤其胶质母细胞瘤患者中位生存期仍不足15个月[8]。胶质瘤细胞的EMT增强了细胞的侵袭能力，胶质瘤细胞广泛侵入周围正常脑组织区域造成脑组织结构和功能严重受损，术后肿瘤周围组织残存的肿瘤细胞使得肿瘤快速复发，因此胶质瘤细胞的高度侵袭性是其预后不佳的主要原因[2,9]，故急需探寻影响胶质瘤侵袭能力的机制。

酪氨酸蛋白激酶受体家族(RTK)是一类酶联受体，能够与配体结合促使酪氨酸残基发生磷酸化，可以调控基因的表达，在细胞的粘附、分化、迁移、增殖、生长及胚胎发育中发挥着作用，同时又可以调控肿瘤的发生形成[10]。EphA1是促红细胞生成素产生肝细胞受体(Eph)家族中重要的一员，EphA1受体可以调控胚胎发育导致胚胎出生后出现差异性，并参与血管形成，借导神经轴突的导向[11]，同时也调控肿瘤的发生形成[6]。已经有相关文献表明EphA1参与肿瘤的发生与进展，例如敲低EphA1表达能够抑制卵巢癌的进程[12]，EphA1在食管鳞状细胞癌中的高表达与淋巴结转移和疾病进展相关[13-14]，EphA1通过调整胃癌肿瘤微环境中VEGF、IL-6细胞因子来影响肿瘤血管新生和炎症微环境,从而促进胃癌的发生和发展[15],EphA1的mRNA的表达水平在膀胱肿瘤组织中明显高于正常组织,且与病理分级、临床分期呈正相关,EphA1能够促进膀胱癌的进展[16]，小干扰RNA沉默EphA1受体对肝细胞癌具有抗血管生成和抗肿瘤作用[17]。但EphA1在已知的肿瘤类型中，并不全是肿瘤促进因子，研究表明EphA1在结直肠肿瘤中明显下调，低表达的EphA1往往与结直肠肿瘤不良预后相关[18]；EphA1蛋白在正常肾小管细胞中表达明显高于肾透明细胞癌，且EphA1蛋白表达水平与肾透明细胞癌核级有关[19]。

由于EphA1在不同肿瘤中具有促进或抑制肿瘤的作用，但目前鲜有关于EphA1在胶质瘤中发生作用的报道。我们首先对比正常星形胶质细胞与胶质瘤细胞系中EphA1的表达水平，研究发现EphA1在胶质瘤细胞系中表达明显高于正常星形胶质细胞，说明EphA1在胶质瘤中可能扮演促进作用。随即通过细胞划痕损伤修复实验发现在胶质瘤细胞系中下调EphA1表达能够明显减低细胞的侵袭能力。EMT赋予细胞转移和入侵的能力，促进肿瘤发展[20-21]，因此我们怀疑胶质瘤中EphA1是否通过影响肿瘤细胞EMT来调节肿瘤的侵袭能力？Snail2是一种已知调节EMT的转录因子，其失调与多种类型的癌症有关[22-23]。我们研究发现胶质瘤细胞系中敲低EphA1表达能够明显抑制Snail2蛋白表达，说明EphA1可能靶向调节Snail2促进胶质瘤的侵袭能力。

综上所述，本研究证明了EphA1在胶质瘤中的作用，并揭示了EphA1可能通过调控Snail2蛋白水平引起胶质瘤细胞发生EMT，从而促进胶质瘤的侵袭能力。这种新型EphA1/Snail2轴为胶质瘤侵袭的机制提供了新的见解，靶向EphA1/Snail2可能是治疗恶性胶质瘤的潜在策略，本研究结果为日后阻断胶质瘤侵袭提供了一个新的潜在方法。