扶正祛邪复方对人白血病细胞HL-60的增殖及凋亡的影响*

张晓丹 周永明 严静贤 祝海霞

［1.河南中医药大学第二临床医学院，河南 郑州 450002；2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437；3.上海市崇明区第三人民医院，上海市崇明区岳阳医院崇明分院，上海 202150；4.上海交通大学医学院附属同济医院宝山分院（大场医院），上海 200043］

急性白血病是常见的造血系统恶性肿瘤，其特征就是骨髓或其他造血组织中白细胞及幼稚细胞的恶性增殖，浸润全身组织及器官，临床表现为贫血、感染、出血等症状。白血病的病情重、死亡率高、进展快等特点使其成为严重威胁人们健康的恶性肿瘤疾病。白血病的发生与白血病细胞的增殖与凋亡失衡相关。诱导白血病细胞凋亡是目前临床常用化疗药物的主要机制，是鉴定药物是否敏感、能否有效的一项指标。虽然目前的化疗已经取得了显著疗效，但是仍不能根治，其毒副作用、复发率高等缺点，迫使我们寻求新的路径。中医药治疗急性白血病具有一定的特色优势。扶正祛邪复方是本文通信作者周永明教授治疗白血病的经验方，在临床使用中取得了一定的疗效。本实验用不同质量浓度的扶正祛邪复方对HL-60细胞进行干预，观察HL-60细胞的增殖及凋亡，为临床疗效提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 HL-60人原髓细胞白血病细胞（原粒细胞，悬浮生长），购自上海中科院细胞库。

1.2 试剂与仪器 生物安全柜（Thermo，1386，USA）；细胞培养箱（Thermo，3111，USA）；倒置显微镜（Olympus，FSX100，Japan）；静 音 混 合 器（Kylin-Bell，BS 223S，China）；电子分析天平（Sartorius，BT 25S，Germany）；超低温冰箱（Thermo，PRIMO，USA）；紫外分光光度计（Thermo，1658001，USA）；流式细胞仪（Beckman Coulter，Cytomicsfc500，USA）；多功能酶标仪（BIOTEK，IX 51，USA）；恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；台式离心机（Thermo，ND2000，USA）；微量移液器（北京大龙公司，China）；Cell Counting Kit-8细胞增殖-毒性检测试剂盒（Rainbio，R3000-4，China）；双抗（MIULTICELL，450-201-EL，USA）；胎牛血清（FBS）（Hyclone，SH30084.03，USA）；细胞周期试剂盒（BD，51-66211E，USA）；Annexin V/FITC细胞凋亡检测试剂盒（BD，556547，USA）；RPMI-1640培养基（Hyclone，SH30809.01，USA）；PBS 缓冲液（Hyclone，SH30022.01B，USA）；0.2 μm除菌滤网（Rephile，RJP3222SH）；流式管（FALCON，21115036，USA）。

1.3 扶正祛邪复方培养液的制备与分组 扶正祛邪中药复方采用天江颗粒，方药为太子参、炒白术、生地黄、制半夏、牡丹皮、炒黄柏、白花蛇舌草、半枝莲、木馒头、炒枳壳、炙甘草等。将中药复方溶于RPMI-1640培养液中，配成100 mg/mL的复方中药培养液。将装有中药药液的玻璃杯置于水浴锅中，加热至100℃，并用玻璃棒匀速搅拌，充分混匀所有颗粒。用0.22 μm无菌滤器过滤至15mL离心管中，封口膜封口，当作母液，4℃保存。实验时用RPMI-1640完全培养液稀释成不同质量浓度的扶正祛邪复方培养液，将pH值调整为7。对照组为正常RPMI-1640完全培养液；实验组质量浓度依次为20、15、10、5、1 mg/mL的中药复方培养液。

1.4 细胞培养 细胞换液遵循悬浮细胞换液的技术，完全遵守无菌操作，每2～3天换液1次，每次添加约5 mL的完全培养基。完全培养液由10%胎牛血清、1%双抗、RPMI-1640培养基组成，调节细胞浓度为1×105/mL，置于5% CO2的细胞培养箱中进行传代培养，取对数期细胞进行实验。

1.5 台盼蓝拒染实验 取对数生长期HL-60细胞，调整细胞浓度为1×105/mL，接种于96孔培养板中，一共6组，每组设3个复孔，共接种3板。每孔加细胞悬液100 μL，培养箱中继续培养2～4 h，待细胞状态稳定后，对照组加入培养基10 μL，各实验组每孔加入不同质量浓度的扶正祛邪复方中药液，分别培养24、48、72 h后，在相应时间点取出一板。用EP管收集各个孔中的细胞，室温下1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入0.3 mL不含血清的培养基，吹打混匀后加入0.4%的台盼蓝溶液0.3 mL，轻轻混匀。2～3 min后，吸取10 μL细胞悬液，从细胞计数板边缘滴入。死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。在低倍显微镜下计数活细胞的数量，并记录。另取EP管中剩余细胞，分装在96孔板中，在倒置显微镜中观察细胞形态。

1.6 CCK-8法检测HL-60细胞的抑制 细胞培养与药物干预步骤同前一实验，在3个时间点分别取出培养板，每孔加入CCK-8试剂10 μL，振荡后放入培养箱中继续培养2～4 h。将96孔板放入酶标仪中，以空白组孔调零，在波长450 nm处测定各孔吸光度值，并计算抑制率。

1.7 流式细胞术检测HL-60细胞周期、凋亡率 选取活力旺盛、呈现对数生长期的HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养基制成以2×106/mL浓度的单细胞悬液，以每孔1 mL接种于无菌6孔板，各空白组加入完全培养液，实验组每孔分别加入不同质量浓度的扶正祛邪复方中药液10 μL。在37℃、5% CO2及95%饱和湿度下，培养48 h后，离心，收集细胞，进行细胞周期检测（按照试剂盒说明操作）。将收集的细胞用预冷PBS洗涤2次，1 000 r/min离心后弃上清，重悬细胞，倒置显微镜下进行细胞计数，调整各组细胞数为1.0×106/mL。取不同质量浓度扶正祛邪中药液处理后的细胞样本，使细胞数达到2×105～1×106个，1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集个细胞，离心弃上清。用PBS洗涤1次，离心弃上清。加入1 mL DNA染色液和10 μL渗透液，涡旋振荡5～10 s混匀。室温避光孵育30 min。选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测细胞周期；细胞凋亡实验细胞培养与中药干预同前，收集细胞后首先按照凋亡试剂盒中的说明，进行仪器的参数调节，然后进行样品的检测。收集1×106个细胞，用预冷PBS离心洗涤2次，弃上清，稀释工作液，用1×Binding Buffer重悬细胞，每管加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI。轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 min。加入500 μL Apoptosis Po在流式细胞仪上，用空白管调节FSC、SSC和荧光通道的电压，并在此电压条件下，用单染管调节荧光通道的补偿，然后样品管进行实验。

1.8 统计学处理 应用SPSS23.0统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差异性时用LSD法，涉及24、48、72 h增殖抑制率比较采用two-ways ANOVA。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 台盼蓝拒染实验观察各组白血病细胞形态 见图1。本实验对台盼蓝染色后的细胞形态进行不同组别之间的比较，观察扶正祛邪复方中药对白血病细胞形态的影响。如图1可见空白组白血病细胞悬浮生长，密度适中，细胞膜完整，细胞质均匀透亮，细胞核清晰，细胞未被染色为蓝色，为透亮；而各实验组的细胞随药物质量浓度的增加，细胞密度逐渐下降，折光性减低，胞体逐渐变小，可见不同数量的被台盼蓝染为蓝色的死细胞。随着中药质量浓度的增加，被台盼蓝染色的细胞增多，说明中药干预后的白血病细胞有凋亡现象，并随着药物质量浓度的增加，细胞凋亡数目增加。

图1 台盼蓝染色后各组细胞形态

2.2 台盼蓝染色细胞计数法检测各组HL-60细胞抑制率 见表1。用细胞抑制率公式计算细胞生长抑制率，并以细胞生长抑制率对药物质量浓度绘制生长曲线。细胞抑制率＝［1-（实验组活细胞数/对照组活细胞数）］×100%。以上实验重复3次，取平均值。数据以重复测量方差分析，结果显示：group与time的交互作用有统计学意义。时间因素方差分析的F值为29.69，P1＜0.05；分组因素方差分析的F值为28.65，P2＜0.01，说明时间层面，同一质量浓度下随着时间的延长扶正祛邪复方对HL-60细胞的抑制作用越强。同一时间点，不同质量浓度组之间随质量浓度的增加，对白血病细胞的抑制率越高。

表1 台盼蓝染色细胞计数法检测各组HL-60细胞抑制率（%，±s）

表1 台盼蓝染色细胞计数法检测各组HL-60细胞抑制率（%，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；同一时间点，与前一质量浓度组比较，△P＜0.05；与本组前一时间点相比较，▲P＜0.05。下同

组别空白组中药1 mg/mL组中药5 mg/mL组中药10 mg/mL组中药15 mg/mL组中药20 mg/mL组24 h 0.00±0.00 7.98±4.27*17.10±4.41△*19.07±8.46△*25.80±11.27△*30.57±5.70△*48 h 0.00±0.00 12.08±5.51*▲21.91±5.75△*▲27.85±8.16△*▲31.74±10.87△*▲35.97±7.57△*▲72 h 0.00±0.00 12.19±5.40*▲22.52±6.34△*▲28.22±4.13△*▲37.63±4.14△*▲42.41±2.37△*▲

2.3 CCK-8法检测各组HL-60细胞的抑制 见表2。测定各孔吸光度值，并计算抑制率，结果以重复测量方差分析，时间因素方差分析的F值为118.9，P1＜0.01；分组因素方差分析的F值为365.4，P2＜0.01，说明时间层面，同一质量浓度下，随着时间的延长扶正祛邪复方对HL-60细胞的抑制率越高；同一时间点，各不同质量浓度组之间随扶正祛邪复方质量浓度的增加，对白血病细胞HL-60的抑制率越高，说明扶正祛邪复方对HL-60细胞活性具有抑制作用，且呈一定的质量浓度与时间的依赖性。

表2 CCK-8法检测各组HL-60细胞的抑制率（%，±s）

表2 CCK-8法检测各组HL-60细胞的抑制率（%，±s）

组别空白组中药1 mg/mL组中药5 mg/mL组中药10 mg/mL组中药15 mg/mL组中药20 mg/mL组24 h 0.00±0.00 4.30±1.90*10.41±2.61△*13.24±0.89△*15.80±1.99△*25.7±1.82△*48 h 0.00±0.00 8.46±0.87*▲16.45±2.13△*▲24.29±2.56△*▲29.97±3.80△*▲36.94±0.72△*▲72 h 0.00±0.00 11.49±1.43*▲18.62±1.73△*▲28.34±2.08△*▲35.60±3.13△*▲42.56±2.33△*▲

2.4 流式细胞术检测各组HL-60细胞周期和凋亡见表3，图2。采用流式仪检测扶正祛邪复方干预白血病HL-60细胞对细胞周期及凋亡的影响。经单因素方差分析，与空白组比较，复方中药组可将HL-60白血病细胞周期阻滞于G1期，S期的细胞比例减少（P＜0.05），并且随着质量浓度的增高，对白血病细胞周期的阻滞作用越强。可以诱导HL-60白血病细胞发生凋亡（P＜0.05），且随着中药质量浓度的增加，细胞凋亡率越高，具有一定的质量浓度依赖性。

图2 各组HL-60细胞周期比较

表3 流式细胞术检测各组HL-60细胞周期和凋亡（%，±s）

表3 流式细胞术检测各组HL-60细胞周期和凋亡（%，±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与中药1 mg/mL组比较，△P＜0.05；与中药5 mg/mL组比较，○P＜0.05；与中药10 mg/mL组比较，▲P＜0.05；与中药15 mg/mL组比较，◆P＜0.05

组 别G1期S期G2期 凋亡率空白组中药1 mg/mL组中药5 mg/mL组中药10 mg/mL组中药15 mg/mL组中药20 mg/mL组39.51±2.53 42.17±2.89*47.02±1.48*△49.46±0.64*△○57.27±2.20*△○▲64.28±4.06*△○▲◆51.48±1.68 46.88±1.53*41.08±1.45*△35.02±2.34*△○28.63±4.79*△○▲23.99±3.54*△○▲◆9.02±1.53 10.96±4.36 11.91±1.73 15.52±1.98 14.10±2.99 11.73±1.37 7.04±5.34 10.38±2.76 14.31±1.60*△19.29±5.76*△○30.00±13.56*△○▲38.27±8.17*△○▲

3 讨论

细胞的增殖和凋亡的动态平衡与肿瘤的发生发展密切相关，白血病的发病也是如此。细胞凋亡是肿瘤机制研究的常见方向与切入点。所谓细胞凋亡是指细胞程序性的死亡，也就是说细胞受到一定的基因调控，按照一定的程序进行自杀性的死亡［1］。细胞凋亡不是病理性细胞死亡，而是另一种生理过程。正常情况下，细胞凋亡使机体细胞数量保持一定的相对平衡，维持着人体稳态。细胞凋亡机制受到一定的抑制时，就会相对地导致细胞增殖的过度。在白血病的发病与进展中，白血病细胞的失控性增殖是造成病情迅速恶化与进展的主要原因，而化疗药物一般就是通过诱导凋亡来抑制白血病细胞的过度增殖。中药干预HL-60细胞诱导其凋亡，主要与PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路、Fas/CD95通路、RaF/MEK/ERK通路、ERK/MAPK通路等细胞凋亡的信号转导系统发挥作用［2-3］。其中PI3K/Akt通路、Wnt/β-catenin通路为目前在肿瘤中研究最为广泛的信号通路，通过药物手段或基因干扰抑制该两条通路的活化均具有较好的抗肿瘤效果［4-5］。这些通路通常与Caspase激活（包括Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性变化）、BAX蛋白表达、BCL-2蛋白表达、Cyt-C蛋白表达、c-myc蛋白、DR5的表达［6-8］等相关。通过对文献的阅读发现，大部分中药都是多靶点地诱导细胞凋亡，通过对不同蛋白、基因的表达来调控信号通路诱导细胞凋亡。

细胞周期是一个细胞从一次分裂完成开始到下次细胞分裂结束所经历的过程。细胞分裂过程异常可能导致肿瘤的发生，细胞的快速生长和分裂是所有肿瘤细胞的共同特征。而细胞周期蛋白是细胞周期调控因子中最重要的蛋白之一，这些周期调控蛋白包括CDC2、CDC7、CDC23、MCAK、mki67a和拓扑异构酶Ⅱ等［9］。这些不仅是正常细胞功能所需的，而且是癌细胞增殖过程中的重要参与者，其异常表达可能引发肿瘤。在白血病中，miR-375-HOXB3-CDCA3/DNMT3B调节通路在疾病进展中起重要作用，在该通路中调低HOXB3表达可降低CDCA3表达，从而抑制白血病细胞增殖［10］。

扶正祛邪方是以扶正、祛邪并举的验方，祛邪不忘扶正，正安则可达邪。全方诸药配伍，清补兼施，益气养阴、清解邪毒。大量临床应用中，本方能改善患者的生存质量，抑制患者化疗期间的呕吐、骨髓抑制等毒副作用，具有增效减毒之功效。本方中的单味中药都具有一定的抗肿瘤作用。其中有研究表明［11］白术内酯能抑制白血病细胞HL-60的增殖活性，抑制小鼠白血病模型中白血病细胞P-388的活力，说明白术内酯具有一定的抗肿瘤作用。何立丽等［12］发现半夏可以调节抑癌基因表达、降低细胞毒性、阻断细胞增殖信号、抑制肿瘤细胞侵袭、化疗增敏、调节细胞周期、逆诱导肿瘤细胞凋亡等作用。Yin等［13］通过流式细胞分析法发现丹皮酚100、200 mg/L组细胞凋亡率显著升高，且促凋亡蛋白的水平显著增高。有研究者通过对乳腺癌紫杉醇多药耐药细胞株（MCF-7/PTX）的研究发现，丹皮酚可以诱导乳腺癌多重耐药细胞株的凋亡［14-15］。扶正祛邪复方具有一定的抗肿瘤的药理学依据。

基于白血病细胞的增殖与凋亡的平衡，我们进行了上述实验，结果显示扶正祛邪复方对细胞活性有着明显的抑制作用。为进一步探讨本方抑制白血病细胞的存活能力是否与诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期有关，本研究使用流式细胞仪检测了不同质量浓度中药干预后的白血病细胞的凋亡变化和周期变化。结果显示扶正祛邪复方干预白血病细胞，对细胞活性有明显的抑制作用，存在细胞凋亡，而随着中药质量浓度的增加，凋亡的细胞数目逐渐增多，早期凋亡与晚期凋亡的细胞都有表现。这说明扶正祛邪复方能诱导白血病细胞的凋亡，且呈剂量依赖性。通过PI单染流式细胞术检测白血病细胞周期的变化，结果显示不同质量浓度的扶正祛邪复方处理白血病细胞后，均可以使细胞周期阻滞在G1期，S期的细胞比例相对减少，且随着扶正祛邪复方质量浓度的增加，阻滞在G1期的白血病细胞数目也逐渐增加，相对的S期的白血病细胞数目也逐渐减少。由此得出本扶正祛邪复方能抑制人白血病细胞HL-60的增殖，其作用机制可能与影响细胞周期及诱导细胞凋亡相关。