白木乌桕中1个新的木脂素葡萄糖苷

赵海燕，王恒山，梁 东

白木乌桕中1个新的木脂素葡萄糖苷

赵海燕，王恒山，梁 东*

广西师范大学化学与药学学院 省部共建药用资源化学与药物分子工程国家重点实验室，广西 桂林 541004

研究白木乌桕醋酸乙酯提取物中木脂素类化学成分及其抗神经炎症和DPPH自由基清除活性。利用多种色谱手段（硅胶、Sephadex LH-20、ODS和制备型HPLC等）对醋酸乙酯提取物的化学成分进行分离纯化，再借助现代波谱手段（紫外、红外、核磁、质谱、圆二色谱）和化学方法对其进行结构鉴定，采用脂多糖（LPS）刺激的BV-2小胶质细胞释放NO模型分析化合物对NO产生的抑制作用，评价其潜在的抗神经炎症活性；另外以维生素C（Vc）作为阳性对照分析化合物对DPPH自由基的清除能力。首次从白木乌桕醋酸乙酯提取物中分离得到2个木脂素葡萄糖苷类化合物，分别鉴定为(−)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷（1）和(+)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷（2）；DPPH自由基清除活性实验结果显示，化合物2对DPPH自由基清除的半数抑制浓度（IC50）为38.1 μmol/L。化合物1为新化合物，命名为白木乌桕糖苷A。与阳性对照Vc相比，化合物2对DPPH自由基有一定的清除能力。

白木乌桕；木脂素葡萄糖苷；抗神经炎症；DPPH自由基清除能力；白木乌桕糖苷A

白木乌桕为大戟科乌桕属植物，原拉丁名为(Sieb. et Zucc.) Pax et Hoffm.，现《中国植物志》将其修订为(Siebold & Zuccarini) Esser，别名白乳木，为野生油脂植物，为灌木或乔木[1]。其在日本和朝鲜均有生长，在我国主要分布在山东、安徽、江苏、浙江、广东、广西等地，喜生于林中湿润处或溪涧边，因为其比较耐寒，部分在海拔1700 m时仍有分布[1-2]。白木乌桕具有消肿利尿的功效，常用于治疗脑水肿、肺水肿等，其根叶对治疗疲劳过度、腰椎疼痛、膝盖疼痛有良好效果[3]。目前对乌桕属植物的研究显示该属植物含有多种药理活性较好的萜类、木脂素类、黄酮类、诃子酸等化学成分[4]。本课题组前期从该植物的茎叶乙醇提取物中分离得到15个黄酮糖苷和苯丙素糖苷，其中有5个黄酮糖苷显示较好的抗神经炎症活性[5]。因此，为了进一步研究白木乌桕的化学成分，从中发现活性先导化合物，继续对白木乌桕茎叶的化学成分进行研究，从中分离鉴定了2个木脂素葡萄糖苷（图1）。并通过紫外（UV）、红外（IR）、质谱、核磁以及圆二色谱（ECD）等波谱手段以及酸水解实验确定了化合物的结构分别为(−)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷{(−)- pinoresinol 4--[6--()- caffeoyl]-β--glucopyranoside，1}和(+)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷{(+)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β-- glucopyranoside，2}，其中化合物1为新化合物，命名为japonicoside A。采用脂多糖（LPS）刺激的BV-2小胶质细胞产生NO模型分析了化合物对NO释放的抑制效果，评价其潜在的抗神经炎症活性；同时分析了化合物对DPPH自由基的清除活性，发现与阳性对照维生素C（Vc）相比化合物2对DPPH自由基具有一定的清除能力。

图1 化合物1和2的化学结构

1 仪器与材料

Agilent 6545 Q-TOF LC-MS高分辨质谱仪（美国Agilent公司）；Bruker AVANCE 600 MHz核磁共振仪（Bruker BioSpin AGFacilities公司）；Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪配有SPD-M20A紫外检测器及SIL-20A自动进样器（Shimadzu公司）；P3000高效液相色谱仪配有UV3000检测器（北京创新通恒科技有限公司）；JASCO圆二色光谱仪（JASCO公司）；柱色谱硅胶（200～300目）及薄层色谱硅胶GF254购自青岛海洋化工厂；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20购自瑞典 Pharmacia Biotech公司；反相柱色谱硅胶RP18（50 μm）、YMC ODS C18色谱柱（250 mm×20 mm，5 μm）和小孔树脂（MCI）CHP20（75～150 μm）分别购自日本的YMC公司和Mitsubishi公司；色谱纯试剂购自美国Tedia和Fisher公司；分析纯试剂购自西陇化工股份有限公司。

样品于2019年4月采集于广西桂林，由广西师范大学生命科学学院唐绍清教授鉴定为白木乌桕(Siebold & Zuccarini) Esser，标本（NJ-201904）保存于广西师范大学西南民族药协同创新中心。

2 提取与分离

白木乌桕干燥茎叶（20.5 kg）清除净杂质后，用90%乙醇70 ℃加热回流提取4次（100 L/次），每次3 h。将4次提取液合并后减压浓缩得到乙醇总浸膏（2.5 kg）。将以上浸膏加水混溶，再依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇分别萃取，得到石油醚、醋酸乙酯、正丁醇和水4个部位。

取醋酸乙酯萃取部位（1.1 kg）过大孔树脂柱，以30%、50%、80%、95%乙醇作为流动相进行梯度洗脱，得到4个组分NJ. A～D。取NJ. C（121.0 g）过MCI柱，以30%～100%甲醇作为流动相，得到共7个组分NJ. C. M1～C. M7。

将组分NJ. C. M6（20.8 g）过硅胶（200～300目）柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）作为流动相，得到NJ. C. M6. G1～C. M6. G6。

将组分NJ. C. M6. G5（353.2 mg）过ODS柱，以30%～100%甲醇作为流动相，共得到7个组分NJ. C. M6. G5. O1～M6. G5. O7。

将组分NJ. C. M6. G5. O2（25.0 mg）经半制备HPLC分离（乙腈-水23∶77，6 mL/min），得到化合物2（4.2 mg，R＝69.0 min）和1（2.1 mg，R＝73.6 min）。

3 结构鉴定

表1 化合物1和2的氢谱和碳谱数据 (600/150 MHz, MeOH-d4)

进一步分析该化合物的2D-NMR数据，可以发现H-1ʺ/H-2ʺ、H-2ʺ/H-3ʺ、H-3ʺ/H-4ʺ、H-4ʺ/H-5ʺ、H-5ʺ/H2-6ʺ的1H-1H COSY相关信号（图2），结合1组较大的偶合常数31ʺ, 2ʺ(7.8 Hz)、32ʺ, 3ʺ(9.0 Hz)、33ʺ, 4ʺ(9.0 Hz)、34ʺ, 5ʺ(9.0 Hz) 可以确定12个脂肪碳中的6个为β-葡萄糖片段（a）的碳信号。随后分析化合物1的HMBC谱，首先可以得到除糖片段以外的如图2所示的b、c、d 这3组C6-C3结构片段。其次根据H2-6ʺ/C-9ʺ′、H-1ʺ/C-4这2个关键的HMBC相关信号，可以确定a、b、d存在如图所示的连接方式。最后根据H-8/8′的1H-1H COSY相关，以及H2-9′/C-7、H2-9/C-7′的HMBC相关，结合分子式可以确定结构片段b和c之间是通过7--9′和9--7′连接的，从而确定了化合物的平面结构。

图2 化合物1的关键1H-1H COSY、HMBC和NOESY相关

通过与类似化合物H-7/H-7′、H-8/H-8′、C-8/C-8′的核磁数据，以及37, 8和37′, 8′的偶合常数对比，推测此化合物木脂素片段的相对构型与pinoresinol和化合物2相同[6-7]。取化合物1.0 mg，加入8%的盐酸1 mL，在80 ℃条件下水解6 h，水解液用醋酸乙酯萃取得到苷元和连有咖啡酰基的葡萄糖片段，连有咖啡酰基片段的糖部分的旋光为正值，从而确定化合物中的糖为β--葡萄糖[5,8]。同时测定了水解后化合物1和2苷元的ECD曲线（图3），从图中可知在238 nm处为正值（＋5.07），277 nm处为负值（−3.19），从而确定其绝对构型为7, 7′, 8, 8′1[6]。最后结合化合物1及水解后得到苷元的负旋光值将其鉴定为(−)-松脂醇 4--[6--()-咖啡酰基]-β--吡喃葡萄糖苷，并命名为japonicoside A。

图3 化合物1和2苷元的ECD谱图

4 生物活性研究

4.1 对NO产生的抑制活性

LPS可以刺激BV-2小胶质细胞释放NO、促炎细胞因子和活性氧等[9]。本实验采用Griess法检测化合物对LPS诱导的BV-2小胶质细胞释放NO的影响[10]，并用MTT法检测化合物对BV-2小胶质细胞存活率的影响[11]。实验结果表明与阳性对照米诺环素（IC50＝15.6 μmol/L）相比，化合物1和2对NO释放的抑制作用均不明显，IC50值大于50 μmol/L。

4.2 DPPH自由基清除活性

DPPH作为一种人工合成的商业自由基被广泛用在抗氧化分析模型中，本实验在评价化合物对DPPH自由基清除能力时以Vc作为阳性对照[12-13]。结果表明在相同的测试条件下，当Vc对DPPH自由基清除率IC50为20.7 μmol/L时，化合物2对DPPH自由基有相对较好的清除活性（IC50＝38.1 μmol/L），而化合物1对DPPH自由基的清除能力较弱（IC50＞100 μmol/L）。初步推测此类化合物中7, 7′, 8, 8′2构型较7, 7′, 8, 8′1构型的分子空间排列更容易与自由基的孤对电子配对，从而影响其对自由基的清除活性。

5 讨论

本实验对白木乌桕中的木脂素类化合物进行了研究，得到的2个木脂素糖苷都是首次从该植物中发现，其中化合物1是新化合物。在对2个化合物的生物活性评价实验中发现，虽然化合物1和2没有明显的抗神经炎症活性，但是化合物2对DPPH自由基有一定的清除能力。本研究不但丰富了白木乌桕的化学成分结构类型，而且对其进一步开发和利用提供了一定的基础理论依据。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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One new lignan glucoside from

ZHAO Hai-yan, WANG Heng-shan, LIANG Dong

State Key Laboratory for Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources, School of Chemistry and Pharmaceutical Sciences, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China

To study the chemical constituents from the EtOAc extract ofand their anti-neuroinflammatory and DPPH-radical scavenging activity.The chemical constituents were isolated and purified by silica gel, Sephadex LH-20, ODS column chromatographies, and semi-preparative HPLC, then their structures were elucidated by extensive modern spectroscopic analyses (UV, IR, NMR, HRESIMS, and ECD) and chemical methods. All compounds were evaluated for their anti-neuroinflammatory activities by inhibiting the nitric oxide (NO) production in lipopolysaccharide (LPS)-activated murine BV-2 microglial cells and their DPPH-radical scavenging abilities with the positive control vitamin C.Two lignan glucosides were isolated from the EtOAc extract ofand identified as (−)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β--glucopyranoside (1) and (+)-pinoresinol 4--[6--()-caffeoyl]-β--glucopyranoside (2). The results of DPPH-radical scavenging activity showed that the IC50value of compound 2 was 38.1 μmol/L.Compound 1 is a new lignan glucoside named as japonicoside A. Compound 2 exhibited moderate DPPH-radical scavenging activity, compared to the positive control Vc (IC50= 20.7 μmol/L).

(Siebold & Zuccarini) Esser; lignan glucosides; anti-neuroinflammation; DPPH-radical scavenging ability; japonicoside A

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5198 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.010

2021-07-21

广西八桂青年学者项目；广西自然科学基金杰出青年项目（2017GXNSFFA198004）

赵海燕（1985—），女，博士研究生，研究方向为天然产物化学。E-mail: 525032442@qq.com

梁 东（1983—），男，沈阳药科大学2006级硕士天然药物化学专业校友，教授、广西师范大学药用资源化学与药物分子工程省部共建国家重点实验室主任助理、广西第一批八桂青年学者、广西自然科学杰出青年基金获得者，主要从事天然药物化学研究。E-mail: liangdonggxnu@163.com

[责任编辑 王文倩]