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miR-6893-5p对前列腺癌LNCaP细胞增殖和迁移的抑制作用及机制研究

2021-09-06王蕾黄耿叶志华姜卫东柯霓

国际医药卫生导报 2021年15期
关键词:明显降低划痕荧光素酶

王蕾 黄耿 叶志华 姜卫东 柯霓

1鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院超声影像科 435000;2鄂东医疗集团黄石市中心医院湖北理工学院附属医院泌尿外科 435000;3肾脏疾病发生与干预湖北省重点实验室,黄石 435000

前列腺癌是最常见的男性生殖系统恶性肿瘤,手术治疗和内分泌治疗是前列腺癌的主要治疗方式[1]。尽管前列腺癌的治疗取得了较大进展,然而多数晚期前列腺癌患者的疗效并不理想[2]。探究前列腺癌发生、发展的分子机制对前列腺癌的临床诊疗意义重大。微小RNA(microRNA,miRNA)是由18~25 个核苷酸组成的内源性RNA,不能翻译为蛋白质[3]。miRNA 通过与其靶基因mRNA 特异性结合,在转录后水平抑制靶基因的表达,在细胞的各种生理和病理过程中发挥重要调控作用[4]。研究表明,miRNA 在包括前列腺癌在内的肿瘤中起到促癌因子或抑癌因子的作用[5]。miR-6893-5p 是一种新发现的miRNA,长度为21 个核苷酸,其在肿瘤中的表达及作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨miR-6893-5p 和前列腺癌的关系,观察miR-6893-5p 对靶基因的调控作用及对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要试剂 RPMI 1640培养基、KSFM 培养基购自美国HyClone 公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。正常前列腺上皮细胞RWPE-1和前列腺癌细胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 购自上海生命科学院细胞所。实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)试剂盒购自日本TaKaRa 公司。携带miR-6893-5p 序列的重组慢病毒、携带无意义序列的重组慢病毒、荧光素酶报告载体[S100 钙结合蛋白A16,S100 calcium binding protein A16(S100A16)野生型及突变型]、miR-NC、miR-6893-5p购自广州锐博生物科技有限公司。双荧光素酶报告检测试剂盒购自美国Promega 公司。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色(MTT)试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。S100A16、GAPDH、N-cadherin、CDK4 抗体购自英国Abcam公司。

1.2 细胞培养和感染 将DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 细胞分别置于含10%胎牛血清RPMI 1640 培养基中,将RWPE-1 细胞置于含10%胎牛血清的KSFM 培养基中,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期的LNCaP 细胞,分别感染携带无意义序列的重组慢病毒(NC组)和携带miR-6893-5p 序列的重组慢病毒(miR-6893-5p组)。RT-qPCR检测感染效果。

1.3 RT-qPCR 检测细胞中miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的表达 用TRIzol 提取上述细胞总RNA,逆转录为cDNA,参照RT-qPCR 试剂盒说明书制备反应体系,反应参数为95 ℃2 min、95 ℃20 s、62 ℃35 s、72 ℃35 s,40 个循环。采 用2-ΔΔCt方法计算,以U6 和GAPDH 为内参计算miR-6893-5p 和S100A16 mRNA的相对表达量。RT-qPCR引物见表1。

表1 实时荧光定量聚合酶链式反应引物序列

1.4 MTT 法检测LNCaP 细胞增殖 将两组LNCaP 细胞以4×103个/孔接种到96 孔板,每组4 个平行孔,培养箱中培养。于接种后第1、2、3、4、5 天,加入15 μl/孔MTT 溶液,避光孵育4 h,弃去孔内液体,加入150 μl/孔DMSO,充分震荡后酶标仪检测460 nm 处的每孔吸光度值(A490值),绘制LNCaP细胞生长曲线。

1.5 划痕实验检测LNCaP 细胞迁移 将两组LNCaP细胞以8×105个/孔接种到6 孔板,每组4 个平行孔。细胞融合度为95%时,利用10 μl 枪头沿6 孔板底部直线划痕,磷酸盐缓冲液清洗,每孔加入2 ml无血清培养基,显微镜下观察测量划痕距离L1。继续培养24 h 后,显微镜下观察测量划痕距离L2,LNCaP细胞迁移率=(L1-L2)/L1×100%。

1.6 双荧光素酶报告基因检测 采用miRNA 靶基因预测软件miRWalk 2.0 预测miR-6893-5p 可能调控的特异性靶基因。将重组S100A16 基因野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒盒和miR-NC、miR-6893-5p共转染LNCaP 细胞,根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测每组细胞的荧光素酶活性。

1.7 Western blot 检测S100A16 及NF-κB 信号通路蛋白表达 两组LNCaP 细胞采用磷酸盐缓冲液清洗,加入裂解液提取总蛋白。每个样品孔加入30 μg蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF 膜。采用5%脱脂奶粉封闭,分别加入一抗4 ℃下孵育过夜。加入二抗在室温下孵育3 h,加入ECL发光试剂,曝光、显影。

1.8 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行分析,符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示,两组比较采用独立样本t检验,多组间均数相比采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-6893-5p在前列腺癌细胞系中的表达 与正常前列腺上皮细胞RWPE-1 相比,前列腺癌细胞系DU-145、PC-3、C4-2B、LNCaP 中miR-6893-5p 表达水平均明显降低(均P<0.05),LNCaP 细胞中miR-6893-5p的表达最低(P<0.01),见图1。

图1 miR-6893-5p在正常前列腺上皮细胞与前列腺癌细胞系中的表达

2.2 慢病毒感染后LNCaP 细胞中miR-6893-5p的表达 NC组和miR-6893-5p组LNCaP 细胞中miR-6893-5p相对表达量分别为(1.07±0.21)和(9.61±1.15),差异有统计学意义(t=7.32,P<0.01),提示携带miR-6893-5p 序列的慢病毒感染成功。

2.3 上调miR-6893-5p 对LNCaP 细胞增殖能力的影响 MTT 检测结果显示(图2),与NC组相比,miR-6893-5p组LNCaP细胞从第2天开始,增殖能力明显降低(P<0.05)。

图2 两组重组慢病毒上调miR-6893-5p 对LNCaP细胞增殖能力的影响

2.4 上调miR-6893-5p 对LNCaP 细胞迁移能力的影响 划痕实验结果显示,NC组和miR-6893-5p组LNCaP 细胞迁移率分别为(72.64±5.69)%和(27.97±5.63)%,差异有统计学意义(t=5.58,P<0.05)。与NC组相比,上调miR-6893-5p后LNCaP细胞的迁移能力被抑制。

2.5 miR-6893-5p 靶向结合S100A16 mRNA miRNA靶基因预测软件miRWalk 2.0 预测显示(图3),S100A16 可能为miR-6893-5p调控的靶基因。双荧光素酶检测系统显示(图4),相比miR-NC,miR-6893-5p的相对荧光素酶活性显著下降(t=13.10,P<0.01),提 示miR-6893-5p 与S100A16 mRNA存在碱基互补配对。

图3 miR-6893-5p与S100A16 mRNA的碱基互补配对位点

图4 双荧光素酶检测系统验证miR-6893-5p的靶基因

2.6 上调miR-6893-5p 对LNCaP 细胞中S100A16 mRNA 表达的影响 NC组和miR-6893-5p组LNCaP 细胞中S100A16 mRNA 相对表达量分别为(1.01±0.07)和(0.22±0.06),差异有统计学意义(t=8.77,P<0.01)。与NC组相比,上调miR-6893-5p 可抑制LNCaP 细胞中S100A16 mRNA的表达。

2.7 上调miR-6893-5p 对S100A16 蛋白表达的影响Western blot 结果显示(图5),与NC组相比,上调miR-6893-5p 后,LNCaP 细胞中S100A16 蛋白表达明显降低,细胞增殖蛋白CDK4、细胞迁移蛋白N-cadherin 表达均降低。

图5 两组重组慢病毒Western blot 检测miR-6893-5p对S100A16蛋白表达的影响

3 讨 论

有研究表明,miRNA在前列腺癌的发生、发展过程中发挥至关重要的作用[6]。miRNA 通过抑制靶基因的表达,表现为肿瘤抑制因子或癌基因作用,miRNA 如miR-29b-3p[7]、miR-16-5p[8]、miR-233-5p[9]等在前列腺癌组织和细胞系中高表达或低表达,与肿瘤大小、临床分期、患者预后等密切相关。miRNA已成为前列腺癌研究领域的热点。miR-6893-5p 是一种新发现的miRNA,其在前列腺癌细胞中的功能和作用机制并不明确。本研究结果显示,miR-6893-5p 在前列腺癌细胞系中表达明显下调,miR-6893-5p 可能在前列腺癌细胞中发挥肿瘤抑制因子。通过感染慢病毒构建miR-6893-5p稳定高表达的LNCaP细胞系,MTT 实验和划痕实验显示,LNCaP 细胞的增殖和迁移能力均明显降低,进一步表明miR-6893-5p 在前列腺癌中具有抑癌作用。

为进一步研究miR-6893-5p 在前列腺癌中的作用机制,通过生物信息学和荧光素酶检测系统发现S100A16 基因是miR-6893-5p的靶基因。S100A16 蛋白是一种小分子酸性钙结合蛋白,属于S100 蛋白家族[10]。S100A16 蛋白在胃癌、膀胱癌等许多肿瘤组织中表达增加,与肿瘤的发生、进展密切相关[11-12]。S100A16 蛋白在前列腺癌组织和细胞系中表达上调,抑制S100A16 蛋白表达可明显降低前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[13]。本研究结果显示,上调miR-6893-5p 后,LNCaP 细胞中S100A16 表达明显降低,进一步表明miR-6893-5p 可靶向抑制S100A16 蛋白的表达。Western blot 结果显示,miR-6893-5p 下调S100A16 表达后,细胞增殖蛋白CDK4、细胞迁移蛋白N-cadherin 表达均降低,提示LNCaP细胞的增殖和迁移能力均被抑制。

综上所述,miR-6893-5p 在前列腺癌细胞系中低表达,上调miR-6893-5p 可通过靶向S100A16 基因抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移,miR-6893-5p 可能成为前列腺癌潜在的治疗靶点。

利益冲突:作者已申明文章无相关利益冲突。

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