不同饲料模型下膳食脂肪对小鼠生理生化指标的影响差异

李鑫,张琳玉,王湘林,刘翔燕,李晓文,王吉,文利新,2*,周迎芳,3*

(1.湖南农业大学动物医学院畜禽保健湖南省工程研究中心,长沙 410128;2.湖南畜禽安全生产协同创新中心,长沙 410128;3.湖南农业大学东方科技学院,长沙 410128)

随着近年来超重、肥胖[1-3]、血脂异常[4]、糖尿病[5]等的发病率高速增长,营养代谢性疾病逐渐成为人们关注的焦点,油脂作为三大供能营养物质之一,其摄入量与营养代谢性疾病的发生发展密切相关。当前以动物实验探究膳食油脂种类对健康的影响时,因高脂(油脂供能40%以上)或富含胆固醇的饮食能缩短实验周期,并且更显著诱导机体病理变化[6-7],大多数研究均以高脂或添加胆固醇饲喂实验动物从而得出不同油脂对健康的影响[8],但高脂高胆固醇饲料模型与居民日常饮食差别很大,因此很难准确模拟人类正常膳食油脂摄入量对健康的影响。

猪油中饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFAs)含量丰富(约50%左右),其单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFAs)含量同样达30%以上,橄榄油作为地中海饮食中典型的膳食用油,因富含极高的MUFA(超过70%),在西方被誉为“液体黄金”,我国是菜籽油最大的生产国、消费国,并且菜籽油是我国长江中下游地区的主导产品[9],其成分也富含MUFA并且多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)也含量较高。

根据世界卫生组织(WHO)和中国营养学会建议,居民日常膳食总脂肪供能比例不宜超过30%,与居民越来越注重少油、少盐饮食的现状,本实验以C57BL/6J雄性小鼠为研究对象,设置油脂供能水平为20%、30%,每个油脂供能水平的饲料油脂分别选择4种油脂,即上述3种富含MUFA的代表油脂(猪油、菜籽油、橄榄油)和猪油与菜籽油的调和油(质量比1∶1,简称调和油),研究在不同油脂摄入水平下该四种油脂对小鼠生长性能、脂肪沉积、血清生化指标以及血糖的影响,探讨膳食脂肪在不同的动物饲料模型下对实验结果的影响,并为居民日常膳食中油脂的选择与食用量提供更全面的实验数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

120只SPF级雄性C57BL/6J小鼠,8周龄,体重18~22 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司【SCXK(湘)2016-0002】,饲养于湖南农业大学动物医学院实验动物中心【SYXK(湘)2019-0017】,室温控制到24~26℃,湿度为50%~60%,昼夜灯光控制周期为12 h,每周2次更换垫料,饲养过程自由采食及饮水。所有实验步骤均通过了中国动物福利与使用指南的授权,并通过了湖南农业大学动物福利委员会的授权,项目审批代码(43321820)。

1.1.2 主要试剂与仪器

胆固醇 (cholesterol,TC)、甘油三酯(triglycerides,TG)低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平、检测试剂盒均购自江苏英诺华医疗技术有限公司、胰岛素购自诺和诺德(中国)制药有限公司生产门冬胰岛素注射液、罗氏血糖仪配套血糖试纸。

动物全自动生化分析仪DS-161V(江苏英诺华医疗技术有限公司),安捷伦气相色谱仪7890A、电子天平AUY120(日本岛津公司)、罗氏血糖仪。

1.2 方法

1.2.1 实验设计

小鼠以基础日粮适应性喂养1周后,随机分为8组,每组15只,分5笼,每笼3只,根据油脂供能水平设置油脂供能水平20%(低油脂供能水平)、30%(高油脂供能水平),每个油脂供能水平分别选用猪油(LA组)、菜籽油(RA组)、猪油菜籽油1∶1调和油(BO组)、橄榄油(OL组)饲喂小鼠,实验周期共16周,每周末称量小鼠空腹体重、计算采食量,第16周末禁食不禁水12 h后进行采血、解剖等。

1.2.2 饲料油脂选择及配方

饲料中猪油由采购自唐人神集团股份有限公司的猪板油炼制所得,菜籽油购自道道全粮油股份有限公司的道道全醇香菜籽油,橄榄油购自WILMAR食用油私人有限公司的特级初榨橄榄油。饲料是由南通特洛菲饲料科技有限公司参照美国营养协会AIN93 M定制生产的纯化饲料(见表1)。

表1 饲料成分表(g/kg)Table 1 Feed composition table(g/kg)

1.2.3 检测方法

(1)油脂脂肪酸含量的测定:根据《食品中脂肪酸的测定》GB5009.168-2016的方法,用安捷伦气相色谱仪7890A对油脂进行脂肪酸含量检测。

(2)样品的采集:实验结束后,小鼠麻醉后取血,取血后脱颈处死,解剖,取小鼠肝(除去胆囊)、肾、心脏、双侧附睾白色脂肪组织(除去附睾组织)和肾周白色脂肪组织称重。将采集到的血液室温静置2 h后,4℃、3000 r/min离心10 min,取上清,-20℃待测。

(3)生长性能的监测:实验开始时,记录每只小鼠的初体重,实验过程中每周称量小鼠空腹体重,计算每笼采食量,实验结束后计算每只小鼠体重增长量、每笼饲料消耗量、计算每笼小鼠食物转化率。

料肉比=每笼采食量g/每笼体重增长量g×100%

(4)体脂沉积的测定:实验结束后测量小鼠体长(鼻到肛门的距离),称量附睾白色脂肪和肾周白色脂肪重量计算肾周脂肪率、附睾脂肪率。

肾周脂肪率、附睾脂肪率=[附睾脂肪(g)或肾周脂肪(g)]/体重(g)×100%

Lee’s index=体重(g)^(1/3)×10/体长(mm)。

(5)器官指数的测定:脏器指数=脏器重量(g)/体重(g)×100%。

(6)血液相关指标的测定:按照仪器及试剂盒说明书检测血清相关指标。

(7)葡萄糖耐量试验(glucose tolerance test,GTT)和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test,ITT)以及终末血糖的测定:

腹腔注射葡萄糖耐量实验(GTT):在实验第8周末20:00将小鼠禁食不禁水12 h至次日8:00。每组随机选定实验小鼠7只,测定空腹血糖后,每克体腹腔注射0.05 mL浓度为40%葡萄糖溶液,测定每只小鼠注射后15、30、60、90 min血糖值并记录。

腹腔注射葡萄糖耐量实验(ITT):实验第12周末8:00禁食不禁水6 h,每组随机选定实验小鼠7只,测定空腹血糖后,小鼠腹腔注射胰岛素,注射剂量为0.5 U/kg,测定每只小鼠注射后15、30、60、90、120 min血糖值并记录。

实验第15周末晚20:00小鼠禁食不禁水12 h至次日早上8:00,测定其空腹血糖。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0处理数据,数据经检验全部符合正态分布,采用平均值±标准误(±s)表示,数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),方差齐时组间采用LSD法,方差不齐时采用Tamhanes T2法。P<0.05为差异具有显著性,P<0.01为差异极具显著性,最后用GraphPad Prism 8软件处理作图。

2 结果

2.1 油脂中脂肪酸成分

油脂脂肪酸含量检测结果如表2所示,猪油SFA∶MUFA∶PUFA为52.1∶35.8∶11.61,菜籽油SFA∶MUFA∶PUFA是7.2∶62.11∶30.02,橄榄油的SFA∶MUFA∶PUFA是14∶79.74∶6.29。由于猪油和菜籽油的复合油是按照1∶1进行混合,所以其SFA∶MUFA∶PUFA约为29.65∶48.96∶20.82。

表2 油脂脂肪酸组成检测Table 2 Detection of fatty acid composition

2.2 不同饲料模型下不同油脂对小鼠生长性能的影响

不同饲料模型下不同油脂对小鼠生长性能的影响如图1所示,图1A、1C小鼠初体重及采食量均显著无差异,图1B、1D可知20%油脂供能水平下,OL组相比于其他三组能显著降低末体重,极显著上升了料肉比。在30%油脂供能水平下,LA组相比于RA组显著增加了末体重,相比于OL组极显著增加了末体重,RA组、OL组相比于LA组、BO组极显著上升了料肉比。以上结果表明:在低油脂供能水平下,橄榄油能降低小鼠末体重,提高料肉比。在高油脂供能水平下,菜籽油和橄榄油都能降低小鼠末体重,提高料肉比。

图1 不同饲料模型下不同油脂对小鼠生长性能的影响Note.Under the same oil energy supply level,different letters indicated significant difference P<0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Effects of different lipids on the growth performance of mice under different feed models

2.3 不同饲料模型下不同油脂对小鼠Lee’s指数、体脂沉积的影响

不同饲料模型下不同油脂对小鼠Lee’s指数、体脂沉积的影响如图2所示,20%油脂供能水平下RA组lee’s指数极显著高于LA、OL组,在30%油脂供能水平下四种油脂lee’s指数无显著差异,两种油脂供能水平下肾周脂肪、附睾脂肪重与其相对脂肪率趋势一致即在20%油脂供能水平下OL组极显著低于其它三组,在30%油脂供能水平下RA、OL组极显著低于LA组、BO组。以上结果表明,在低油脂供能水平下,菜籽油升高了Lee’s指数,橄榄油能减少肾周脂肪、附睾脂肪的积累,在高摄入水平下,菜籽油与橄榄油都能减少肾周脂肪、附睾脂肪的积累。

图2 不同饲料模型下不同油脂对小鼠Lee’s指数、体脂沉积的影响Figure 2 Effects of different lipids on Lee’s index and body fat deposition in mice under different feed models

2.4 不同饲料模型下不同油脂对小鼠肝、肾指数的影响

不同饲料模型下不同油脂对小鼠肝肾、指数的影响如图3所示,图3A、3B肝指数所示,两种油脂供能水平下OL极显著高于其它三组,图3C、3D肾指数所示,在20%油脂供能水平下RA组显著高于其它三组,在30%油脂供能水平下,LA、RA组显著高于BO、OL组。以上结果表明,两种供能水平下,橄榄油会升高肝指数,菜籽油会升高肾指数,在高摄入量下,猪油也会升高肾指数。

图3 不同饲料模型下不同油脂对小鼠肝、肾指数的影响Figure 3 Influence of different lipids on liver and kidney indexes of mice under different feed models

2.5 不同饲料模型下不同油脂对小鼠血脂的影响

不同油脂对小鼠血脂的影响如图4所示,图4A血清TC含量检测,在20%油脂供能水平下,LA组显著高于其它三组。在30%油脂供能水平下,RA组显著低于其它三组。图4B血清TG含量检测,在20%油脂供能水平下,RA组显著高于其它3组,在30%油脂供能水平下,OL组血清TG含量最低。图4C、4D血清HDL-C、LDL-C含量的检测,LA组小鼠其血清HDL-C、LDL-C含量均较高,RA组与其相反,但从HDL-C/LDL-C比值来看,如图4E所示,在20%油脂供能水平下RA组极显著高于其它三组并在30%油脂供能时仍较高,而LA组和OL组在四种油脂供能水平下HDL-C/LDL-C比值均无显著性差异。以上结果表明:两种油脂供能水平下,菜籽油均可通过降低血清TC含量改善血脂,橄榄油可通过降低血清TG水平改善血脂。从血清HDL-C/LDL-C比值来看,猪油与橄榄油相比无差异,而菜籽油能升高其比值从而改善血脂。

图4 不同饲料模型下不同油脂对小鼠血脂的影响Figure 4 Influence of different lipids on blood lipid in mice under different feed models

2.6 不同饲料模型下不同油脂对小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的影响

不同油脂对小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的影响如图5所示,20%油脂供能水平下,图5A葡萄糖耐量试验(GTT)曲线下面积BO组显著低于LA组、OL组,图5B胰岛素敏感性实验(ITT)曲线下面积OL组显著低于BO组。图5C终末空腹血糖测定来看,20%油脂供能水平下四组小鼠无显著性差异,但在油脂供能水平为30%时,BO组小鼠末血糖略有上升,但总体空腹血糖值都较低并未造成胰岛素抵抗。以上结果表明:低油脂供能水平下猪油菜籽油1∶1调和油、橄榄油对血糖的调控更好,但本质上两种油脂供能水平下四种油脂均未造成小鼠血糖调控失衡。

图5 不同饲料模型下不同油脂对小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的影响Figure 5 Effects of different lipids on glucose tolerance and insulin sensitivity in mice under different feed models

3 讨论

在居民日常膳食用油中,地中海饮食所提倡的橄榄油一直被人们推崇,有报道称含有橄榄油、坚果等健康脂肪的饮食并不容易造成体质量增加[10],一项荟萃分析的结果同样指出,橄榄油饮食可以起到对体重控制的作用[11],在本研究中20%的油脂供能水平下,橄榄油确实体现了对体重的控制、减少了脂质的积累。菜籽油同样有助于减肥[12],在30%油脂供能水平下,菜籽油对体重、体脂的作用效果与橄榄油是一样的,这表明在不超过高油脂供能水平的条件下菜籽油与橄榄油同样可以起到对体重的调节。Lee’s指数与肥胖高度相关,在20%油脂供能水平下,RA组lee’s指数最高,可能是其体长较短的原因。肝指数[13]、肾指数[14]可以反映脏器肿胀和炎性浸润程度,结果表明,在20%、30%的油脂供能水平下,橄榄油均上升了肝指数,并且在解剖过程中发现食用橄榄油的小鼠肝相较于其他组颜色苍白,这说明橄榄油对肝功能可能产生了不利影响,这很可能造成20%、30%的油脂供能水平下食用橄榄油小鼠体重较轻的原因,在20%、30%的油脂供能水平下,食用菜籽油小鼠的肾指数显著上升,可能是菜籽油中芥酸引起的,并且在30%的油脂供能水平下猪油也升高了肾指数,这表明菜籽油或过高食用猪油可能对肾造成不利影响。

油脂中脂肪酸种类对机体健康也有所差异,研究表明,MUFAs(如油酸等)可以改善餐后血脂水平、改善胰岛素抵抗等[15-16],PUFA中C18∶2n-6c(亚油酸)能降低血清LDL-C水平从而改善CVD[17],并且富含n-3 PUFAs的膳食油脂摄入能有效改善血脂、改善糖脂代谢[18-19]。从油脂组成成分结果来看,橄榄油中MUFA含量最高达79.74%,这可能是其降低小鼠血清TG含量的重要原因,菜籽油相比于其他油PUFA含量最多,其中C18∶2n-6c(亚油酸)占20.7%,n-3 PUFAs中C18∶3n-3(亚麻酸)占9.32%,并且这可能是在实验中菜籽油降低血清TC含量并且其HDL-C/LDL-C值较其他油脂高的原因。

GTT、ITT、空腹血糖的测定反映了机体对血糖的调控能力,有实验表明高脂条件下不同油脂对血糖的调控没有本质区别[20],在实验中同样发现两种油脂供能水平下猪油、菜籽油、橄榄油对小鼠血糖调控、胰岛素敏感性的影响一致。这表明膳食油脂可能并不是造成血糖紊乱、胰岛细胞受损的唯一原因。

4 结论

本研究共构建两种动物饲料模型,每种模型下选用4种常见的膳食油脂,猪油、菜籽油、橄榄油、猪油菜籽油1∶1调和油,探讨不同的动物饲料模型下不同油脂对实验结果的影响,得出在30%油脂供能水平下猪油与猪油菜籽油1∶1调和油能增加小鼠体重和脂肪沉积,在20%、30%油脂供能水平下,橄榄油减少体重,减少了脂肪沉积,但可能对肝功能产生不利影响,菜籽油对血脂的改善最好,但其增加了肾指数,四种油脂均未造成小鼠血糖调控能力受损。