亨廷顿氏病的神经兴奋和线粒体毒性发病机理与动物模型

唐文洁,黄艳,王力峰,魏佑震*,谢元云*

(1.同济大学附属东方医院转化医学研究中心,教育部心律失常重点实验室,上海 200120;2.山东大学齐鲁儿童医院康复科,济南 250022;3.赣南医学院附属第一医院国家老年病临床研究中心,江西 赣州 341000)

亨廷顿氏病(Huntington’s disease,HD)是一种常染色体显性遗传神经退行性疾病,主要临床表现为运动、智力、心理功能障碍[1]。其主要的病理变化表现在大脑基底核的纹状体,以纹状体传出型棘状神经元的大量缺失为著,可以累积更广泛脑区甚至皮质。纹状体属于锥体外系,当大量神经元丢失时,肢体运动功能受限,出现症状。流行病学调查表明,全世界HD的平均发病率为5/100 000~8/100 000,以欧美洲和非洲裔发病率最高,呈逐年增高趋势。美国HD的发病率为4.1/100 000~8.4/100 000,美国现有约3万HD患者,其HD基因携带者(自身或后代可能发病)有15万人。亚洲尤其东亚裔HD发病率较低,发病率约为0.42/100 000,说明HD发病有种族差异[2-3]。HD是致命的,最常见HD的发病年龄为30岁~40岁[4],患者发病后存活时间约10年~15年,发病后期患者生活不能自理,给家庭和社会带来巨大护理及经济负担。至今临床上对HD尚无有效的治疗或预防措施,针对各种HD症状的药物和控制措施效果不理想,甚至由于药物毒副作用太大而不得不终止治疗。为更全面认识HD发病机理、研究兴奋性神经毒性和线粒体能量代谢异常所致的脑组织及神经元损伤分子机制,研发相应的治疗性药物及方案,了解并掌控相应的动物模型十分重要。本文综述介绍以HD组织病理学及生物化学为发病机制而建立的HD动物模型,即兴奋性神经毒性模型和线粒体毒素模型。

1 兴奋性神经毒素喹啉酸(quinolinic acid,QA)诱导的HD动物模型(QA模型)

1.1 造模机制

QA兴奋性神经毒性机制研究得比较清楚[5-11](图1),QA是体内犬尿氨酸(Kynurenine)代谢产物之一。通过食物被摄入的色氨酸(tryptophan)在体内一些中性氨基酸载体的协助下,通过血脑屏障抵达脑组织,被脑组织的星形胶质细胞、小胶质细胞等吸收,经细胞内色氨酸双加氧化酶(tryptophan dioxygenase)催化转化成犬尿氨酸,后者在羟基黄烷酸酶(3-hydroxyanthranitic acid)催化下分解成QA和其它代谢产物。正常生理代谢水平的QA并不会造成细胞毒性;然而超出生理水平,即便少量增高的QA将引起细胞毒性和死亡。Tatter等[12]的研究发现QA可以增加动物纹状体变异亨廷顿蛋白(mutant Huntingtin,mHTT)水平,而正常亨廷顿蛋白对QA引起的细胞损伤有保护作用[13]。这些研究结果支持异常脑内QA水平增高与HD的相关性。

图1 QA兴奋性毒性机制示意图Figure 1 Schematic diagram of QA excitotoxicity mechanism

研究发现HD在包括基因转录、细胞转运和蛋白质降解等方面显示细胞功能异常[14-15]。但在此之前,兴奋性毒性的HD发病机制,即通过谷氨酸受体过量信号传导引起的神经损伤,得到了大量研究结果支持。首先提出兴奋性神经毒性在HD发病机制中的作用,是通过对啮齿类动物纹状体内,注射两种犬尿氨酸内源性代谢产物QA或红藻氨酸(kainic acid,KA),可以诱导许多类似HD样神经化学和组织病理学特征[16-20]以及HD样的行为缺陷[21-23]。后来通过研究更多HD患者和动物模型发现:兴奋性传导通路NMDA和mGluR5受体信号传导异常,以及线粒体膜钙离子通道激活和钙内流失调。因此,HD是mHTT引起的多因素导致兴奋性谷氨酸受体活性增高和钙信号传导失衡所致[24-25]。

兴奋性神经毒性作为HD关键致病因素的进一步证据,来自于检测犬尿氨酸内源性的代谢途径产物。N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体激动剂QA在YAC128小鼠纹状体和大脑皮质明显增加。此外,另外一种犬尿氨酸代谢产物3-羟基犬尿氨酸(3-HK),已知可增强QA介导的兴奋性毒性,也在YAC128小鼠的大脑皮层和纹状体升高[26]。在早期HD患者大脑皮质和新纹状体也发现类似的QA和3-HK含量升高[27];并且这种增高的量和疾病严重程度相关[28-29]。QA和3-HK在介导兴奋性神经毒性方面作用以及HD患者和YAC128小鼠脑组织内源性代谢水平增高,支持HD兴奋性神经毒性的发病机制。

1.2 造模方法

1.2.1 啮齿类动物大(小)鼠脑纹状体(尾状核)内注射QA模型

大鼠QA造模方法[30]如下:体重180~200 g的Wistar大鼠,经腹腔注射硫喷妥钠30 mg/kg诱导麻醉。大鼠对趾压刺激失去反应并呼吸和心跳平稳后,头颅立体定位:将头部俯卧固定于立体定位仪上,调整定位仪左右耳杆和齿杆高度,使大鼠头顶部位水平。麻醉后动物腹部放置加热垫以维持动物正常体温摄氏37℃左右,再给动物眼球涂干净润滑剂以确保眼球湿润和保护眼角膜。将手术部位(约1 cm2)毛发剃净,先涂碘伏后涂70%乙醇,共3次,然后皮下注射布比卡因50μL局部麻醉。

用手术刀沿头顶正中线切开皮肤,尽量往外侧分开以暴露顶颅骨。确认Bregma以及颅顶前后左右侧在同一水平高度。从前至Bregma-0.6 mm,从外侧至Bregma 2.6 mm,从硬脊膜至腹侧深4.5 mm。用医用牙钻在注射点颅骨钻小孔后,用2μL Hamilton微量注射针(30 Gauge)将0.5μL 300 mmol/L QA生理盐水(pH=7.4)于4 min内缓慢注射完。1 min后,小心缓慢地将注射针提升移开。确保没有活动性出血后,缝合手术切口,用生理盐水清洗创面,皮下注射叔丁啡止痛,将动物转移到苏醒处继续保温观察,直到动物术后麻醉完全苏醒恢复活动后,归鼠笼正常饲养。

小鼠QA造模方法和大鼠QA造模基本相同[31]。选用体重25~30 g的成年小鼠,包括C57BL/6、C57BL/10和FVB/N等不同种系小鼠,并且使用小鼠立体定位仪按成年小鼠大脑立体定位注射参数,即从前至Bregma 0.3 mm,从外侧至Bregma 1 mm,从头顶部至腹部深2.5 mm,给药剂量体重比同大鼠。

1.2.2 非人类灵长类动物(狨猴)脑内注射QA模型

QA造模方法[32]为:2~3岁狨猴,雌雄皆可,先经腹腔注射氯胺酮0.05 mL(Vetalar,Parke Drive Veterinary),然后使用Saffan(安泰酮:成分二羟孕烷二酮和羟-5α-孕烷二酮)(0.1 mL/100 g,Pitman-Moore,UK)诱导麻醉。观察动物麻醉至手术水平,呼吸和心跳平稳后,将其头部俯卧固定于猴脑立体定位仪上,调整定位仪左右耳杆和齿杆高度,使头顶部位水平。其余与大鼠准备相同。

雾化吸入治疗过程中,确保患儿采取坐位或者半坐卧位,使膈肌下移,便于雾化吸入后肺部充分扩展,增加气体的交换量。

用手术刀沿头顶正中线切开皮肤,往两侧分开以暴露头顶颅骨。确认Bregma以及颅顶前后左右侧在同一水平高度。按Bregma位置用立体定位仪分别标定尾状核和壳核注射点位置,立体定位注射点位置参数可参考Kendall等[32]的方法。在注射点颅骨钻小孔后,用2μL Hamilton微量注射针(30 Gauge)将0.15~0.25μL 0.1 mol/L QA生理盐水(pH=7.4)按0.1μL/min速度缓慢注射完。留针1 min后,小心缓慢地将注射针提升移开。确保没有活动出血后,缝合手术切口,生理盐水清洗创面,皮下注射安定(Valium,Roche,5 mg/mL)0.05~0.2 mL,以控制手术后抽搐,将动物转移到避光处,直到动物术后麻醉完全苏醒,恢复活动后,回归笼养。

1.3 模型评估主要指标

1.3.1 兴奋性毒性造成的行为学改变

由于QA的急性兴奋性神经毒性作用,通常动物被注射QA麻醉苏醒后,立刻呈现神经损伤症状。单侧纹状体注射QA,动物将出现躁狂、跳跃、步态不稳及不对称的单向循转或跑动等。这种非对称性运动是单侧纹状体受损引起多巴胺信号传导通路左右不平衡所致。QA诱导的这种异常活跃不稳定行为和HD患者早期运动功能障碍相似。术后0.5~1 h内,这种异常的行为将缓慢地减少,动物逐渐趋于稳定,并且出现明显活动减少,和HD晚期患者症状相似。Morris水迷宫、放射臂水迷宫、T型水迷宫等测试结果表明QA神经毒性损伤了动物的认知功能。这些行为测试评估的动物工作和参考记忆,需要皮质纹状体通路的参与才能完成[22,24-25,33]。Rotarod平衡运动测试也经常用于检测受损伤动物的运动和学习功能,和对照组相比,QA损伤动物在Rotarod转轴上掉落次数增加和停留时间减少,表明QA损伤了动物的学习和运动技能。被动游泳实验用以观察动物在一个玻璃圆柱体内游泳行为,纹状体受伤动物在水面漂浮不动时间明显长于对照动物,说明QA损伤导致动物降低了求生欲望。

1.3.2 兴奋性毒性造成的神经组织损伤

纹状体注射QA后7 d左右,动物麻醉后经心灌注4%多聚甲醛,取脑,30%蔗糖PB浸透,恒冷切片,25~30μm,FLUORO-JADE®C组织化学染色。和对照动物相比,QA引起动物受损纹状体组织显著绿色荧光显色(图2)。QA兴奋性神经毒性引起的神经细胞死亡,包括细胞坏死和凋亡,与HD神经细胞死亡机制相似[17]。QA损伤导致与HD患者脑组织相似的选择性神经损伤和病理改变,比如GABAergic,脑啡肽和P物质免疫染色阳性神经元显著减少,这与青少年发病HD的脑神经元丢失相似;相反,有些神经元比如胆碱乙酰转移酶免疫阳性染色神经元则相对不受影响[34]。

图2 纹状体FLUORO-JADE®C组织化学染色Note.A.Group QA.B.Control group.Figure 2 FLUORO-JADE® C HistochemicalStaining of Striatum

1.4 模型特点

QA通不过血脑屏障,因此QA诱导的兴奋性神经毒性模型必须脑内给药,一般是通过脑立体定位手术在纹状体给药。尽管如此,建立本模型的手术步骤比较简单,一般实验室条件下可以完成。该模型重复性较好,稳定性和可靠性高。QA是一种常用而且容易取得的化学试剂,经济适用;可应用于多种实验动物,包括啮齿类大小鼠和灵长类动物比如猴等。根据实验要求和目的不同,QA可以注射到单侧或双侧纹状体,也可以注射不同QA的量,以控制损伤的范围和严重程度,操作灵活。最后,该模型的检测和评估也比较简单,可以进行组织病理学和行为学检测等。

QA兴奋性神经毒性引起的神经病理学和行为学改变都是急性的,这和HD的渐进性和慢性发病不同;HD是一种遗传性神经退行性疾病,而QA兴奋性神经毒性引起的急性神经损伤没有任何遗传和其它因素参与;与HD不同,QA不会诱导mHTT聚集体形成;HD病程长以及发病早期和晚期临床表现通常不同,这与QA兴奋性神经毒性导致纹状体损伤后出现的症状也不同。这是在选择这类动物模型模拟HD时需要考虑的。

1.5 模型应用

兴奋性神经毒性导致的脑神经损伤,是最早提出的HD发病机制。QA模型已经被广泛研究和特别应用于寻找HD的治疗措施[35-36]。由于QA产生明显和可以预测的神经元死亡,QA模型经常被用来检测一些神经保护作用的药物和评估HD治疗效果。Emerich等[37]利用双侧纹状体注射QA的大鼠模型测试经过基因改造的睫神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF),发现CNTF可以预防纹状体的细胞丢失以及减少大脑皮质萎缩等。通过QA模型,研究也发现其它几种神经营养因子比如脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)和胶质细胞系衍生的神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF),可以保护HD动物模型受损的纹状体神经元[38-40]。神经元过兴奋毒性损伤是神经元跨突触死亡的一种形式,QA引起神经元损伤模型具有神经元损伤及保护、修复研究的普适性。可以用于研究神经元过兴奋毒性损伤机制以及相应神经修复保护类药物的研发[35-36,38-39]。

2 线粒体毒素3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)诱导的HD动物模型(3-NP模型)

2.1 造模机制

基于线粒体功能受损和能量代谢紊乱学说,使用线粒体毒素诱导急性线粒体受损和能量代谢紊乱引起纹状体病变[5,7-8,41-44],而建立HD模型(见图3)。这类神经毒素包括线粒体抑制剂,例如丙二酸和3-NP,造成靶向电子传递链的复合物降低ATP水平并导致细胞能量损耗[45-46]。降低的ATP水平,导致细胞和线粒体部分膜去极化,减弱电压依赖性Mg2+阻断NMDA受体,引起纹状体NMDA受体依赖性的继发兴奋性毒性损伤[47-48]。这些线粒体毒素,已经被广泛用于啮齿类和灵长类动物以建立HD模型和相关研究[45,48-58]。

图3 3-NP造模机制示意图Figure 3 Schematic diagram of 3-NP producing animal models

HD患者大脑和周围组织中线粒体功能缺陷,反映了mHTT可能对线粒体产生直接影响[69,72-73]。例如,mHTT可能改变线粒体膜形成的钙离子通道,而直接影响线粒体钙离子流通[69];或者,mHTT可能干扰线粒体裂变和融合过程中的细胞器功能,导致线粒体变性和功能障碍[74]。3-NP是一种引起啮齿类和灵长类动物神经元化学改变的线粒体毒素,可以引起大脑皮质神经元线粒体分裂和最终引起细胞死亡;但这种毒性作用可以被NMDA受体拮抗剂所阻断,揭示HD能量代谢障碍是通过NMDA受体介导所致[46,56,75]。此外,表达mHTT的HeLa细胞在氧化应激时,线粒体受损裂解片段化增多;而抑制线粒体裂变或促进线粒体的融合,却可以防止mHTT导致的线粒体片段化和相关的细胞死亡[76]。

更多直接来自YAC转基因动物模型的研究证明,mHTT对线粒体作用可以增强NMDA受体介导的兴奋性神经毒性。利用原代培养的YAC46小鼠的中棘神经元,证明辅酶Q10可以抑制线粒体的环孢菌素A和bongkrekic acid(是一种由假单胞菌分泌的线粒体毒素,线粒体腺嘌呤核苷酸(ADP/ATP)转位酶的特异性配体),从而减少线粒体膜渗透性和减少NMDA受体介导的细胞死亡等神经保护作用[77]。对YAC128小鼠的中型多棘神经元研究也获得了跟上述类似结果[78-79]。这些研究结果表明,线粒体功能受损和兴奋性神经毒性可能是mHTT诱发的HD早期发病的细胞内分子机制。

2.2 造模方法

2.2.1 纹状体(尾状核)局部注射3-NP的动物模型

3月龄雄性SD大鼠,经腹腔注射戊巴比妥50 mg/kg诱导麻醉。基础准备工作同前。

沿头部正中线切开皮肤,暴露头顶颅骨。确认Bregma以及颅顶前后左右侧在同一水平高度。按Bregma位置从前至Bregma-0.4 mm,从外侧至Bregma 2.6 mm,从硬脊膜至腹侧深4.5 mm。在注射点颅骨钻小孔后,用Hamilton 10μL微量注射针(30 Gauge)将1μL 3-NP溶于水,按20 mg/(kg·mL)(pH 7.4)在1 min内缓慢注射完[17,45]。后续工作同前。

2.2.2 腹膜腔注射3-NP的动物模型

腹腔注射3-NP剂量递增模型:雄性SD大鼠520~560 g,Lewis大鼠340~370 g,和Fisher大鼠270~300 g经腹腔注射3-NP,首剂量7 mg/kg体重,然后逐日按15%增加剂量,至动物死亡。Fisher大鼠对3-NP毒性耐受最差,动物用药3~4 d死亡,其次是SD大鼠,于用药后10~11 d死亡,最耐受3-NP毒性的是Lewis大鼠,可以耐受药物毒性15~16 d[80-81]。

腹膜腔注射3-NP恒量急性损伤模型:大鼠经腹膜腔注射3-NP,剂量为20 mg/kg体重,连续4 d。

2.2.3 皮下注射3-NP的动物模型

急性诱导模型:(1)浓度为80 mg/mL的3-NP溶于去离子水并用1 mmol/L NaOH将pH调整为7.4。Lewis大鼠皮下注射3-NP(20 mg/kg体重),每天8:00和17:00各1次,连续5 d。(2)通过氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠后,于皮下包埋渗透给药泵(alzet osmotic pump)持续释放给药:每天3-NP剂量为20 mg/kg体重,溶度为20 mg/mL,连续5 d[45]。

慢性诱导模型:通过大鼠皮下包埋Alzet Osmotic Pump持续释放3-NP,每天剂量为12 mg/kg体重,连续1个月[82]。

2.2.4 肌肉注射3-NP的动物模型

浓度为150 mg/mL的3-NP溶解于去离子水并用1 mmol/L NaOH将其pH调整为7.4。预实验动物3-NP每天剂量为10 mg/kg体重,每天肌注2次,分别为8:00和17:00,1周后动物出现明显胃肠道副作用如呕吐等,因此,实验动物肌注射剂量调整为每天5 mg/kg体重。1周后每天剂量在原剂量基础上增加1 mg/kg体重,直至总剂量8 mg/kg体重,此后每天增加剂量改为0.5 mg/kg体重,至动物出现明显急性神经损伤症状时停止用药,比如动物出现呕吐嗜睡和疲乏症状,这些症状通常会持续约48 h;同时伴随步态不稳异常以及后肢活动障碍和眼球活动失调等。停药3~5 d后,上述症状将会缓解[83]。

2.3 模型评估

3-NP可以特异性损伤线粒体琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)而影响能量代谢。Túnez等[81]研究了经腹腔注射3-NP的大鼠模型,每天剂量为20 mg/kg体重,连续4 d,发现3-NP能够显著抑制琥珀酸脱氢酶活性,与对照组比,减少60%;同时,3-NP明显增加脑尤其是纹状体神经元的脂质过氧化以及蛋白碳基化合物(protein carbonyls)水平和过氧化物歧化酶(superoxide dismutase)活性[81]。

Guyot等[84]观察经腹腔注射或皮下长期给药,与对照组比,3-NP可以选择性地损伤纹状体以及海马CA1区神经细胞,引起神经损伤包括胶质反应等,而大脑皮质则相对不受其影响。Ouary等[80]发现3-NP这种对脑和神经元选择性损伤。大鼠注射3-NP 5 d后,动物纹状体神经元细胞核可见DNA损伤以及细胞核裂解。焦油紫和Hoechst 33285组织化学染色以及TUNEL染色均证实纹状体神经元凋亡。免疫组织化学染色发现Calbindin免疫阳性染色细胞减少,与纹状体中型多棘神经元丢失相吻合;而NADPH-diaphorase和ChAT阳性神经元则免受影响,显示3-NP可以选择性地损伤纹状体神经元[80]。

Palfi等[83]观察了3-NP对狨猴纹状体损伤引起的运动功能障碍。5~8岁的狨猴每天两次肌注3-NP,剂量从5 mg/kg体重开始,然后剂量逐渐增加直至动物出现明显神经损伤症状。3-NP的急性神经损伤症状包括轻微不协调步态以及后肢运动障碍。此外,动物动眼神经功能也出现异常,比如不能协调左右水平和上下垂直眼球运动。损伤2~4周后,动物出现舞蹈样动作,以下肢为著,导致活动不协调,逐渐波及全身包括头面部,由于肌肉控制失调出现怪异表情等[83]。

2.4 模型特点

由于3-NP可以通过血脑屏障,建立模型时给药方便,可以采用经腹腔、皮下或肌肉注射途径。3-NP的药物毒性会影响动物体重,在建模过程中每天可以根据动物实际体重及时调整药物剂量。无论采用任何一种途径给药,模型建立的可靠性和重复性高。此外,还可以根据不同实验要求,采用大剂量诱导急性损伤或低剂量长期给药诱导损伤。3-NP模型导致的神经元损伤和HD线粒体功能紊乱引起的神经病变,以及神经功能障碍和HD有不少相似之处,所以该模型已经被广泛用于HD线粒体损伤机制和相关神经保护治疗的研究。尽管如此,3-NP诱导的线粒体损伤以及导致的神经病理和功能改变,毕竟与HD由于基因突变经过长期慢性积累和体内外环境因素参与的HD神经病理变化,有着本质不同。

2.5 模型应用

HD线粒体功能和能量代谢障碍,使得3-NP模型特别适合于该线粒体损伤机制的研究,以及寻找针对线粒体受损保护的药物和治疗方案的研发[45,47-48,85]。Bachoud-Lévi等[86]发现CNTF可以改善3-NP诱导的运动功能障碍。有研究表明GDNF可以保护3-NP引起的纹状体受损神经元,以及改善动物的运动功能[87]。两个研究团队用Coenzyme Q10治疗3-NP引起的线粒体损伤,发现可以重建部分受损的线粒体功能[88-89]。

3 结论

综上,当今最为广泛应用于HD病理机制和治疗研究的是啮齿类HD动物模型。在众多HD动物模型中,可以根据研究目标而选择不同动物模型。通过非遗传机制建立的HD动物模型主要有兴奋性神经毒性QA模型和线粒体毒素3-NP模型,这些动物模型在帮助认识亨廷顿氏病以及探寻HD的治疗发挥了重要作用。由于篇幅所限,目前广泛应用的亨廷顿氏病转基因动物模型没有在本文介绍。