大鼠慢性缺血性肢体疼痛模型的探索性构建

周游,吴茗慧,汪雯,2,杜俊英,邵晓梅,蒋永亮,刘伯一,梁宜,3*,方剑乔,3

(1.浙江中医药大学第三临床医学院针灸神经生物学实验室 浙江省针灸神经病学重点实验室,杭州 310053;2.衢州市中医医院,浙江 衢州 324202;3.浙江中医药大学附属第三医院针灸科,杭州 310053)

严重肢体缺血(chronic critical limb ischemia,CLI)代表周围血管闭塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease,PAOD)的最后阶段,其特征在于难治性疼痛和组织坏疽,出现缺血性休息疼痛、溃疡或坏疽,伴随动脉供血不足的血液动力学依据[1-2]。CLI的发病率占成年美国人口1.3%~2.3%,随着人口老龄化的增加呈逐年增长趋势。在没有成功进行血运重建的情况下,多达40%的患者需要截肢,年死亡率超过20%[3]。CLI存在高发病率和高死亡率,预后较差,并且患者往往需要长期忍受疾病伴随的缺血性休息疼痛,严重影响患者的生存质量[4]。目前针对此项肢体性缺血的相关研究,更多将目光放在了血管性疾病如动脉粥样硬化等疾病的预防和治疗上,而忽略了CLI引起的缺血性肢体疼痛这一症状,因此需要有更多针对缺血性肢体疼痛这一症状的关注。

选择恰当的肢体缺血性模型开展研究,是推动肢体缺血发展机制研究和创新治疗手段过程中必不可少的重要环节。目前现有模型存在明显不足,针对慢性缺血性疼痛这一疼痛类疾病尚未有较好的动物造模方法。现有缺血类动物模型侧重于关注血管损伤带来的疾病状态,而非慢性缺血引起的疼痛状态,存在与临床疾病不符以及手术带来额外损伤等问题。因此,本研究使用O型圈通过将SD大鼠下肢近膝关节处小压力值缓慢加压,观察患侧大鼠足跖PWTs、足跖厚度、足跖皮温和足跖局部血流情况等指标,以期探索一种新型的慢性缺血性肢体疼痛模型,便于后续研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

16只6周龄SPF级雄性SD大鼠,体重(180±20)g。购自中国科学院上海实验动物中心【SCXK(沪)2018-0006】,由浙江中医药大学实验动物中心饲养【SYXK(浙)2018-0012】。饲养期间给予啮齿类动物标准颗粒饲料(由实验动物中心提供)及自由饮水,12 h循环灯光,恒定湿度,室温(23±2)℃。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理调条例》,本实验所有操作均符合浙江中医药大学实验动物管理与伦理委员会实验伦理学要求(伦理审批号:IACUC-20190715-03)。

1.1.2 主要试剂与仪器

异氟烷(生产厂家:鲁南贝特制药有限公司;批号:64170901)。RFP-WX1801压力测量仪(生产厂家:宇博智能科技有限公司;型号:601,量程:005 N);薄膜压力感应器(型号:RFP-601,量程500 g);激光多普勒血流灌注成像仪(生产厂家:帕瑞医疗科技有限公司;型号:1100047s);医用红外体温计(生产厂家:速尔康有限公司;型号:PC868);游标卡尺(生产厂家:上海美耐特实业有限公司;型号:MNT-150);麻醉剂空气泵(生产厂家:瑞沃德有限公司;型号:C9M01-002);氧气流量计(生产厂家:瑞沃德有限公司;型号:C5D01-062);橡皮圈1.2 N型(内径10 mm,宽度5 mm、橡皮圈2.2 N型(内径12 mm,宽度5 mm)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备

慢性缺血性肢体疼痛(chronic ischemia-induced limb pain,CILP)大鼠模型制备方法为:如图1所示,清醒状态下,实验大鼠用布套固定,将橡皮圈套于大鼠左后肢股部,橡皮圈下缘距离膝关节约1 cm处作为固定施加压力点(局部备皮后,用记号笔标记固定点)。按照表1所列具体参数施以加压处理模拟人体肢端慢性缺血。

表1 大鼠CILP造模参数设置表Table 1 Rat CILP model parameter setting table

图1 大鼠加压和压力测定示意图Figure 1 Schematic diagram of rat pressurization and pressure measurement

1.2.2 分组处理

将CILP组给予相应造模处理;假模型组仅使用橡皮圈(做剪断处理)疏松地系于相同部位,其余处理与CILP组相同。

1.2.3 指标检测

主要检测实验大鼠足跖PWTs、足跖厚度、足跖皮温和足跖局部血流情况,具体检测时间点见实验流程图(见图2)。

图2 实验流程图Note.Blue area in the figure refers to the band time period.Figure 2 Experimental flowchart

(1)PWTs检测:分别于造模前,加压后D8、D13、D20四个时间点测定双侧足跖的PWTs,于解除橡皮圈束缚2 h后在30 min内完成PWTs测定。正式测定前将大鼠置于铁丝网上的透明有机玻璃箱内(20 cm×20 cm×15 cm),使其适应环境30 min。待大鼠停止梳理毛发和探索性活动,选用不同Von Frey丝(0.4、0.6、1、2、4、6、8、15、26 g)垂直刺激大鼠右后足底中部,向大鼠足垫施加压力至Von Frey丝轻微弯曲并持续5 s。若大鼠出现缩腿或舔足反应则为阳性反应,记为“X”并给予相邻小一级力度的刺激。当该力度的von Frey纤维刺激不能引起阳性反应时,则记为“O”并给予相邻大一级力度的纤维刺激,每次刺激间隔30 s。由此可得到一串以“O”或“X”组合的序列,并使用Chaplan等[5]描述的方法进行计算。若计算得出50%PWTs>26.0 g或<0.4 g,仍以26.0 g或0.4 g作为最大或最小值。有待注意的是,本次实验检测PWTs时间点为加压后2 h。经由前期预实验结果表明,加压后短时间内如0.5 h,大鼠足跖部检测效果不佳,虽大鼠足跖部出现明显黑紫肿胀,却未有检测到痛阈下降,猜测可能是短时间内大鼠由于足跖部疼痛过度而导致对Von frey丝的刺激未有反应,故将检测时间点更改为加压后2 h。

(2)足跖厚度:分别于造模前,加压后D6、D13、D20四个时间点测定双侧足跖的厚度值。橡皮圈束缚结束1 h内完成足跖厚度测定。在25℃的安静环境中,将大鼠置于布套内候其安静,检测者固定大鼠腿部使其充分暴露足跖部,使用游标卡尺读取大鼠患侧足跖部厚度(足背高点与足底的垂直高度),连续取3次测量值的均值记为该足跖部厚度。

(3)足跖皮温:分别于造模前,加压后D6、D13、D20四个时间点测定双侧足跖的皮温值,橡皮圈束缚结束30 min内完成足跖部皮温测定。在25℃的安静环境中,将大鼠置于布套内候其安静,检测者固定大鼠腿部使其充分暴露足跖部,以红外线温度计连续3次测定大鼠患对侧足底的皮温,取3次数值的平均值作为该侧足底皮温。

(4)足跖血流:分别于造模前,加压后D6、D13、D20四个时间点观测记录双侧血流情况,观测经过3周缓慢加压后,CILP组和sham CILP组两组大鼠患对侧足跖部血流情况;并且于造模D20再行检测加压前、加压时、加压后CILP组和sham CILP组患对侧血流情况,即加压前后血流情况示意图。橡皮圈束缚结束30 min内完成多普勒测定。将待测大鼠于麻醉状态下进行局部血流血流检测,采用异氟烷(输出浓度为2%)以500 mL/min氧气流量进行低流量吸入麻醉。打开激光多普勒血流灌注成像仪,使用PIM Soft软件,镜下找到合适监测点来观测患对侧的足跖部血流,记录1 min内大鼠患对侧足跖部的平均血流灌注量。

1.3 统计学分析

本研究中所有数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据采用平均值±标准差(±s)表示,不满足正态分布则采用中位数表示(P25,P75)。采用独立样本t检验、重复测量方差分析(正态分布)或秩和检验(非正态分布)进行比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠痛阈变化情况

加压前(D0),两组大鼠对、患侧足跖PWTs均无明显差异。加压后13、20 d,CILP大鼠患侧足跖PWTs均显著低于同期假模型组(P<0.01);CILP大鼠对侧足跖PWTs在加压后13、20 d时低于同期假模型组大鼠(P<0.01)结果提示单侧加压导致的慢性缺血性肢体疼痛可诱发双侧肢体出现疼痛,患侧呈现出渐进性疼痛,对侧呈现出与患侧同步疼痛(见图3)。

图3 各组大鼠不同时间点PWTs变化情况Note.Compared with the contralateral sham CILP group,*P<0.05,**P<0.01.Compared with the ipsilateral sham CILP group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.(The same in the following figures)Figure 3 Changes of PWTs at different time points in each group of rats

2.2 各组大鼠足跖厚度变化情况

加压前(D0)、加压后6 d(D6)两组大鼠双侧足跖部厚度均无明显差异。加压后13、20 d后,CILP大鼠患侧足跖部厚度均显著高于同期假模型组和同期对侧(均P<0.01)。CILP大鼠对侧足跖部厚度出现轻度增厚,在加压后13、20 d时低于同期假模型组大鼠(P<0.01,P<0.05)(见图4)。

图4 各组大鼠不同时间点足跖部厚度变化情况Figure 4 Changes of paw thickness at different time points in each group of rats

2.3 各组大鼠足跖皮温变化情况

加压前(D0),两组大鼠双侧足跖皮温均无明显差异。CILP大鼠患侧足跖皮温加压后6、20 d时均显著低于同期假模型组(P<0.01),对侧足跖皮温在D13时有一过性升高(P<0.01)。而且CILP组大鼠加压后6、13、20 d患侧足跖部皮温明显低于同期对侧(P<0.01)(见图5)。

图5 各组大鼠不同时间点足跖皮温变化情况Figure 5 Changes of paw skin temperature at different time points in each group of rats

2.4 各组大鼠足跖血流变化情况

于橡皮圈束缚结束30 min内行多普勒检测。加压前(D0),两组大鼠双侧足跖平均血流量无差异。加压后20 d,CILP大鼠对侧和患侧足跖平均血流量均显著低于同期假模型组(P<0.01)(见图6)。

图6 各组大鼠不同时间点足跖血流灌注量变化情况Figure 6 Changes of paw blood perfusion unit at different time points in each group of rats

进一步观察了大鼠在橡皮圈加压(束缚期)、加压后(束缚后)不同时点的足跖平均血流量变化情况,结果如图7所示,加压30 min时患侧足跖平均血流量明显减小呈低灌注状态,肉眼可见足跖呈现瘀血状。加压后10 min,大鼠患侧足跖平均血流量呈现短暂的充盈,提示患侧肢体于加压后存在缺血再灌注现象。

图7 不同时间点大鼠足跖部代表图Note.A.Experimental flowchart.B.Representative images of rat paw.C.Doppler representative images of CILP rat paw.Figure 7 Representative images of rat paw at different time points

3 讨论

肢体缺血性模型是研究严重肢体缺血甚至外周动脉疾病的基础,能够模拟临床肢体缺血疾病的症状和体征,为肢体缺血疾病的研究提供科学依据。由于严重肢体缺血发病机制复杂、多样,因此需要各种具有临床针对性的理想的肢体缺血动物模型。在现有的动物模型中,制备方法上存在动脉结扎法、动脉期收缩法、骨折后固定法、诱导血管栓塞法以及加压止血带法,方法上较为多样,尚未有统一定论。

模型中存在手术制备的模型为动静脉结扎法[6-7]、动脉收缩器法[8-9],以及骨折后固定法[10],造模过程中手术创伤较大,具有人为因素以及造成二次损伤;诱导血管栓塞法则包括通过经皮耳廓动脉等使用大颗粒混合物注射以进行远端肢体血管的大颗粒致血管栓塞法[11],以及使用氯化亚铁诱导法[12]导致特定动脉的缺铁性缺血,均存在大颗粒制备操作复杂、注射剂量不可控的问题,目前相关后续研究较少。现有研究较多采用的模型制备为加压止血带法,包括O型圈止血带法[13]以及可控压力止血带法[14-16]。前者为麻醉情况下,将止血带(紧密贴合的O形环)放置在麻醉大鼠的单侧后肢靠近踝关节处3 h,之后将其移除使之再灌注。在再灌注后2~4 h后,大鼠表现出缺血性后爪的充血和水肿/血浆外渗[13]。由于该模型涉及到多种疼痛如神经病理性疼痛、炎性痛等,其余常见研究方向为复杂性区域疼痛的相关机制,也有用于缺血预处理的相关机制研究。Hu等[17]采用机械痛、热痛等痛行为学方法进行评价该模型的缺血性疼痛程度。但是考虑到该类缺血再灌造成的缺血性疼痛于临床上少见,多为模拟临床上外科手术长时间使用止血带造成的缺血再灌注情况,尚存在改进空间。此外,类似止血带的应用上加入了可控压力这一概念,即可控压力止血带法。Bonheur等[14]最早使用环状橡皮筋在小鼠的大腿近端施加分级的周向张力,通过转动绞盘将止血带的张力增加到0.2 kg会引起缺血。通过释放止血带上的张力来启动再灌注。Drysch等[15]研究表明,为了诱导局部缺血,将止血带缠绕在小鼠后肢上,使用0.6 N的力引起血管闭塞。可控压力止血带法均为利用压力感应器械的非手术侵入法,可较为精准模拟不同压力下的缺血情况。值得注意的是,所选用实验动物不同以及达到血流阻塞的效果不同,应选用的压力值也有所区别。李飞等[16]发现,使用该法在血管吊带两端施加3.3 N的压力值,可在8~10周SD大鼠上建立后肢缺血处理模型,达到后肢完全缺血的效果。在此研究基础上,本研究基于非手术制备以及贴合临床的考虑,采用改良版加压止血带法,本研究使用O型圈将SD大鼠下肢近膝关节处小压力值(1.2~2.2 N)缓慢加压,以期更贴合临床上缺血性疼痛的产生状况。

上述模型中,针对血管性疾病如血管栓塞[18]及动脉粥样硬化[19]等疾病有较为全备的研究,而对于严重肢体缺血引起的难治性疼痛,则相关模型较少,目前较为公认的为CPIP(chronic post-ischemia pain,CPIP)模型,也是研究复杂区域疼痛综合症(complex regional pain syndrome-Type I,CRPS-I)的常用动物模型[13]。该类疼痛模型在方法上也属于O型圈止血带加压法,但是制备过程中存在肢体完全性急性缺血3~4 h后再灌注的情况,与临床上常见的缺血性疼痛的成因有所不同,对临床慢性缺血性疼痛指导意义稍有欠缺,因此需要研究更为贴合临床中慢性以及下肢非完全性缺血症状的模型。本研究可显示出慢性缺血性下肢疼痛类疾病中持续性疼痛、肢端冰冷、局部肿胀以及血流量降低等特点[20]:造模20 d完成加压后,CILP组大鼠患对侧PWTs显著降低,模后大鼠出现患侧肢体疼痛,伴有对侧肢体一过性疼痛;CPIP组大鼠患侧足跖部厚度均显著增高,模后患侧足跖皮温降低、对患侧足跖平均血流量均显著低于同期,可较好模拟临床慢性缺血性疼痛。值得注意的是,在加压13、20 d,CILP组大鼠对侧PWTs均显示出下降趋势,出现这一现象的或与镜像痛(mirror-image pain,MIP)的产生机制类似。在许多神经病性疼痛(neuropathic pain,NPP)的实验动物模型中报告了由周围神经损伤引起的镜像痛[21],例如慢性坐骨神经压迫损伤模型(chronic constriction injury,CCI),脊神经结扎模型(spinal nerve ligation,SNL)和坐骨神经分支损伤模型(spared nerve injury,SNI)。据临床报道,5%患有复杂区域疼痛综合症的患者观察到双侧肢体的疼痛症状[21]。因此,认为本研究中出现该种现象在一定程度上还原了临床。

综上所述,对大鼠进行长时间后肢小压力值缓慢加压可成功建立模型,能够广泛应用于严重肢体缺血类慢性下肢缺血性疼痛类疾病,对严重下肢缺血等疾病有重要应用价值。诚然本模型构建中也存在造模时间长、尚未有后续相关研究等问题,仍处于模型研究的探索性阶段,期待随着对大鼠慢性缺血性肢体疼痛模型的研究不断深入,能有更贴合临床更利于后续研究的动物模型成功研制。