补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀型子宫内膜异位症FoxO1介导的细胞自噬水平的影响

孟鑫,李颖,张宇,曹璨,白羽,陈景伟

(河北中医学院中西医结合学院,中西医结合研究所,河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室,石家庄 050200)

子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)简称内异症,是一种常见的具有侵袭性的妇科疾病,指在宫腔以外的部位出现子宫内膜组织(腺体和间质),并于该处不断生长、浸润、反复出血而引起的一种慢性病变[1]。临床上主要表现为痛经、慢性盆腔疼痛、月经失调及不孕等,发病率高达5%~10%,并呈现逐年增长的趋势,严重影响着患者的精神及生活质量[2]。EMs的发病机制错综复杂,涉及多种因素与机制,但尚无定论。近年来研究发现,细胞自噬水平异常与EMs的发生存在着密切关系。细胞自噬的发生是一个多因素调节的过程,其水平受到多条信号通路的调控[3]。近年叉头框转录因子O1(forkhead transcription factors O1,FoxO1)在自噬调节中的作用倍受关注。FoxO1是FoxO转录因子家族中重要的一员,是一类关键的自噬调控因子,已被证实在细胞周期进展和肿瘤发生发展中发挥着重要作用[4]。核因子KappaB(NF-κB)是细胞内普遍存在的重要转录因子,激活NF-κB可诱导多种炎性因子、抗细胞凋亡因子等的释放,介导调控细胞自噬,是多条信号转导的途径,广泛参与机体炎症、应激反应等生理病理过程,从而促进EMs的发生发展[5]。

目前,EMs的西医治疗主要以手术与药物为主,且存在治疗不彻底及术后复发率高的局限性[6],缺乏理想的治疗效果。中医认为EMs的病机之本为肾阳亏虚,瘀血阻滞[7],补肾温阳化瘀方具有补肾温阳,祛瘀止痛的功效,本实验通过观察补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀型EMs大鼠模型FoxO1、NF-κB及自噬相关因子水平的影响,从细胞自噬的角度探究补肾温阳化瘀方治疗EMs的作用机制,为补肾温阳化瘀方的临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

100只SPF级雌性SD大鼠,8~10周龄,体重200~250 g;购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0011】;实验动物饲养及后续观察于河北中医学院科研中心进行【SYXK(冀)2017-005】,期间给予标准颗粒饲料,自由饮水,室温(23±2)℃,光照明暗各12 h,通风良好,适应性喂养1周。所有操作均符合河北中医学院伦理委员会的相关伦理审批(编号:DWLL2020031)。

1.1.2 实验药物

补肾温阳化瘀方(组成:肉桂、制附子、小茴香、川牛膝、吴茱萸、狗脊、桑寄生、延胡索等)免煎颗粒剂,统一购自神威药业;孕三烯酮胶囊,每粒2.5 mg(北京紫竹药业有限公司,批号:53190501);戊酸雌二醇片(补佳乐)(拜耳医药保健有限公司广州分公司,批号:469A);异氟烷(100 mL,批号:201805);硫酸庆大霉素注射液(石药集团欧意药业有限公司,批号:068180408)。

1.1.3 主要试剂与仪器

FoxO1A抗体(abcam公司,批号:ab39670);NFκB p65抗体(abcam公司,批号:ab16502);LC3B抗体(Sigma公司,批号:049M4783V);Beclin-1抗体(abcam公司,批号:ab210498);GAPDH(Servicebio公司,批号:P04406);HRP标记的山羊抗兔IgG(Servicebio公司,批号:GB23303)。

小动物麻醉机(美国MIDMARK公司,品牌及型号:MATRX,VMR);电子测痛仪(品牌及型号:Model 2391);实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD,型号:CFX96);凝胶成像仪(Image Quant,型号:LAS 4010);病理图文分析系统(日本,型号:DP72CCD)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及造模方法

100只SPF级雌性SD大鼠适应性喂养1周后,80只大鼠采用自体移植法结合冰浴复制肾阳虚血瘀型EMs模型[8-9],设假手术组20只。造模前3 d所有实验大鼠以戊酸雌二醇片1 mg/kg灌胃,每日检测其阴道细胞学涂片,人工造成实验动物处于统一的动情周期。造模时手术全过程在小动物麻醉机下进行,采用异氟烷持续吸入方式麻醉大鼠,将异氟烷倒入麻醉机中,取1只大鼠放入诱导盒内,1 min后大鼠麻醉成功,取出仰卧位固定,并为其戴上面罩,以维持麻醉效果。碘伏常规消毒腹部皮肤,铺巾,选取尿道口上方约3 cm处正中开腹,切口约2 cm,找到左侧子宫,剪下中间一段子宫(约2 cm),立即置于无菌生理盐水中,分离附着于子宫浆膜面脂肪组织,纵形剖开子宫,将分离好的子宫组织内膜面紧贴在右侧腹壁,并用4-0可吸收线将子宫块对角缝合固定于腹腔内壁,硫酸庆大霉素0.1 mL留置腹腔,逐层常规关腹。假手术组麻醉、开腹同上,只需找到其左侧子宫后缝合腹部切口即可。手术操作保持无菌,全程操作5 min内完成,术后注意保暖,待其自然苏醒,苏醒后正常清洁饲养。术后连续3 d腹腔注射庆大霉素0.1 mL预防感染,术后第4天除假手术组外开始冰浴,大鼠5只一笼,笼中加入0~1℃冰水混合物,深度为150 mm,每天1次,每次30 min,连续3周复制肾阳虚血瘀型EMs模型(见图1)。

图1 自体移植法造模+冰水浸泡Note.A.Part of endometrium was transplanted into abdominal wall during autotransplantation.B.After autotransplantation.C.Soaked in ice water mixture.Figure 1 Model was made by autotransplantation and soaked in ice water

建模成功标准:在内异症造模成功的基础上出现肾阳虚寒证表现[10-11]即为建模成功:(1)移植物体积增大;(2)移植物表面有血管形成;(3)移植物呈小囊状,内含清亮液体;(4)病理检查移植物中有子宫内膜腺体和间质细胞;(5)大鼠出现身脏毛污,反应迟钝,蜷缩懒动,后肢行动迟缓、寒战,扎堆怕冷、爪尾部苍白,尾部皮下瘀紫、耳色苍白等表现。

1.2.2 药物制备及用药方法

考虑到细胞作用区域的变形梯度较大(局域变形)，采用二阶形函数可以得到更为准确的测量结果。公式(2)(下标2表示形函数阶数)给出了二阶形函数的表达形式，具有更多的自由度，其参数矢量由一阶形函数的12行增加为30行，能够描述的变形也从一阶变形(伸缩、转动、剪切或其组合)扩展到二阶变形(如梁的纯弯曲)。

将所购得的中药免煎颗粒剂溶于双蒸水中,制成补肾温阳化瘀方高剂量药液(含生药量4.625 g/mL)、补肾温阳化瘀方低剂量药液(含生药量1.85 g/mL)。将一粒孕三烯酮胶囊内药物溶于100 mL双蒸水中,制成浓度为0.025 mg/mL的药液。

移植术后第4天各组开始冰浴,同时按以下方案灌胃给药,灌胃容积按照1 mL/100 g体重计算:中药高剂量组:中药高剂量药液(46.25 g/kg,临床等效剂量2.5倍),每天1次灌胃;中药低剂量组:中药低剂量药液(18.5 g/kg,临床等效剂量),每日1次灌胃;西药组:孕三烯酮(0.25 mg/kg,临床等效剂量),每周2次灌胃给药,其余时间灌胃等体积的纯净水;模型组及假手术组同时灌胃等体积纯净水,连续灌胃3周。

1.2.3 组织的收集与处理

采用2%戊巴比妥钠溶液以45 mg/kg的剂量进行腹腔注射麻醉,开腹后观察异位病灶形态,迅速取出异位灶组织和在位子宫组织,称重后部分组织置入4%多聚甲醛溶液中固定,部分组织置于液氮,后转入-80℃冰箱保存待测。

1.2.4 观察指标及检测方法

(1)一般状况观察:观察实验大鼠的外观、体重、精神状态、饮食、二便等变化情况。开腹后观察异位病灶组织生长情况,HE染色于镜下观察异位病灶组织的病理学改变。

(2)机械痛阈值(PWT):在保持安静的环境下将大鼠放置于透明的观察箱中,使大鼠适应环境约30 min,待其安静后进行测定。采用机械性电子测痛仪进行测量,探针沿铁丝网边缘逐渐刺向大鼠后爪正中,后匀速施加压力,当大鼠出现缩腿或逃跑行为时,记录仪器屏幕上所显示的压力值(精确度0.1 g),此压力值即为机械痛域值。

(3)脏器指数:称取实验大鼠体重,麻醉后迅速取出其胸腺、脾和在位子宫,剪除多余脂肪组织,以生理盐水清洗后称重,计算脏器指数。脏器指数=脏器湿重(mg)/体重(g)×100%。

(4)免疫组化检测FoxO1、NF-κB及自噬相关因子的蛋白定位表达:采用SP法,实验操作按照试剂盒使用说明书进行:石蜡切片、烤片,二甲苯脱蜡2次,不同浓度梯度乙醇溶液水化后于蒸馏水中洗涤3次,滴加3%H2O2室温孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶,PBS洗涤3次后进行抗原修复20 min,后加正常山羊血清室温孵育10 min,滴加一抗4℃过夜,次日滴加二抗常温孵育15 min,PBS洗涤3次,滴加辣根过氧化物酶后进行DAB显色,苏木精复染后脱水封片,显微镜下观察组织中FoxO1、NF-κB、LC3-I、LC3-II及Beclin-1的表达情况。

(5)Western Blot测定FoxO1、NF-κB及自噬相关因子蛋白的表达:将标本转移至离心管中,100 mg组织加入400μL裂解液,置于冰上用匀浆机充分研磨匀浆30 min,离心,提取上清液后,加入四分之一体积的5×上样Buffer,震荡混匀后变性,冷却离心,放置-80℃冰箱保存备用。按照配方配制10%分离胶和5%浓缩胶,放入加满电泳液的电泳槽中上样,上样结束后进行SDS-PAGE电泳、半干法转至PVDF膜,5%牛奶室温封闭1 h、一抗4℃孵育过夜,次日用HRP标记的山羊抗兔二抗(1∶5000)孵育1 h,显色液A、B按1∶1配制发光液,用凝胶成像分析系统检测蛋白结果,采集图片。实验以GAPDH作为内参蛋白,用Quantity One分析软件对蛋白条带灰度值进行分析。

(6)RT-PCR检测FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的表达:取组织经液氮研磨,加入RNA裂解液,按照试剂盒方法提取组织总RNA,紫外分光光度计测定RNA的纯度,然后配制20μL逆转录反应液体积进行逆转录反应,获得的cDNA于PCR仪应用两步法反应程序上进行实时荧光定量PCR反应,95℃10 min进行预变性,然后进行44个循环反应:95℃15 s,60℃60 s。引物由上海生工设计并合成,GAPDH上游引物序列:5’-AGGAAATGATGAC CTCCTGAACT-3’,下游引物序列:5’-TGTTTTTGT AAGTATCTTGGTGCCT-3’,扩增长度79 bp;NF-κB上游引物序列:5’-TGTATTTCACGGGACCTGGC-3’,下游引物序列:5’-CAGGCTAGGGTCAGCGTATG-3’,扩增长度110 bp;FoxO1上游引物序列:5’-CAGCCAGGCACCTCATAACA-3’,下游引物序列:5’-TCAAGCGGTTCATGGCAGAT-3’,扩增长度143 bp;LC3-I上游引物序列:5’-TTGGTCAAGATCAT CCGGCG-3’,下 游 引 物 序 列:5’-CGAAGGTTT CTTGGGAGGCA-3’,扩增长度172 bp;LC3-II上游引物序列:5’-TGTTAAGCCCCTACCAAGGC-3’,下游引物序列:5’-ATGGCACTCAGTTTCTGGCT-3’,扩增长度129 bp;Beclin-1上游引物序列:5’-AACTCTGGAGGTCTCGCTCT-3’,下游引物序列:5’-CGCCTTAGACCCCTCCATTC-3’,扩增长度131 bp。扩增完毕后,进入结果分析界面,以GAPDH为内参照基因,得到各样本各目的基因及内参基因的Cq值,按照公式Q=2-ΔCq,得到每个目的基因的Q值及Q均值,再以每个目的基因的Q值/Q均值,即各目的基因表达的相对定量值(RQ值),将RQ值用于统计分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0统计软件进行数据分析,计量资料均以平均值±标准差(±s)表示,满足正态性和方差齐性检验者,采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较用SNK法,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般状况及异位灶观察

移植术后21 d,与假手术组大鼠相比,其余4组大鼠均陆续出现体温下降、精神萎靡、反应迟钝、蜷缩拱背、抱团少动、畏寒肢冷、行动迟缓、便溏、体毛稀疏、杂乱无光泽、采食量与饮水量减少等症状,初步判断肾阳虚血瘀型证候模型成功。EMs主要病理性增殖的外在表现为异位病灶的生长及体积的变化,开腹探查,除假手术组外,其余各组均见移植物生长,造模成功率为100%。大体观察可见模型组的异位病灶体积明显增大,重量增加,腹壁上可形成单个或多个小囊泡,呈半透明状,内含大量透明或淡黄色清亮液体,质地柔软,囊泡表面覆盖着丰富的血管网,与周围组织粘连明显。与模型组相比,各治疗组异位病灶的体积明显减小、重量减少、内含液体减少、血管形成不明显、粘连情况也较少(见图2)。

图2 各组EMs大鼠异位病灶的生长情况比较Note.A.Model group.B.High dose group.C.Low dose group.D.Western medicine group.Figure 2 Comparison of the growth of ectopic lesions in EMSrats of each group

2.2 各组异位病灶的组织病理学观察

异位病灶HE染色后于镜下观察,假手术组的子宫内膜结构完整、上皮细胞呈长柱状排列、整齐连续,多数为间质细胞,腺体和血管丰富;模型组可见异位内膜上皮细胞以低柱状细胞或立方状细胞为主,呈环形或锯齿状生长,部分区域内膜也可呈乳头状生长,且有炎性细胞的浸润,其间质层可见血管丰富,腺体数量减少,甚至消失,肌层结构不清晰。中药高剂量组、中药低剂量组和西药组的异位内膜均可见不同程度的上皮细胞变薄,多为扁平状或低立方状,呈现出萎缩性改变,部分异位内膜腺上皮明显被破坏甚至消失(见图3)。

图3 补肾温阳化瘀方对大鼠子宫及异位灶组织病理的影响Figure 3 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on the pathology of uterus and ectopic focus in rats

2.3 各组实验大鼠之间机械痛域值的变化

与假手术组相比,模型组大鼠所测得的机械痛阈值显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组和西药组大鼠所测得的机械痛阈值显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠之间机械痛阈值的比较(±S,n=20)Table 1 Comparison of mechanical pain threshold among groups(±S,n=20)

表1 各组大鼠之间机械痛阈值的比较(±S,n=20)Table 1 Comparison of mechanical pain threshold among groups(±S,n=20)

注:与假手术组相比,*P<0.05;与模型组相比,▲P<0.05。Note.Compared with sham operation group,*P<0.05.Compared with model group,▲P<0.05.

组别Groups机械痛域值Mechanical pain threshold假手术组Sham operation group 72.32±10.58模型组Model group 55.92±11.22*中药高剂量组High dose group 72.07±20.78▲中药低剂量组Low dose group 71.73±22.20▲西药组Western medicine group 67.37±22.61▲

2.4 对脏器指数的影响

与假手术组相比,模型组大鼠的胸腺、脾及子宫指数均显著降低(P<0.05,P<0.01);与模型组相比较,中药高剂量组的胸腺及子宫指数显著上升(P<0.05,P<0.01),脾指数无统计学意义(P>0.05);中药低剂量组和西药组的胸腺、脾及子宫有上升趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀型EMs大鼠胸腺、脾及子宫指数的影响(±S,n=20)Table 2 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on thymus,spleen and uterus index of EMSrats with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome(±S,n=20)

表2 补肾温阳化瘀方对肾阳虚血瘀型EMs大鼠胸腺、脾及子宫指数的影响(±S,n=20)Table 2 Effect of Bushen Wenyang Huayu Recipe on thymus,spleen and uterus index of EMSrats with kidney yang deficiency and blood stasis syndrome(±S,n=20)

注:与假手术组相比,*P<0.05,**P<0.01;与模型组相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01。(下图/表同)Note.Compared with sham operation group,*P<0.05,**P<0.01.Compared with model group,▲P<0.05,▲▲P<0.01.(The same in the following figures and tables)

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2.5 各组大鼠在位内膜和异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子蛋白的定位表达比较

免疫组织化学染色显示,FoxO1、Beclin-1、LC3和NF-κB免疫阳性显色均呈现棕黄色,FoxO1主要定位于子宫腺体腺上皮细胞质内;Beclin-1在腺体细胞和间质细胞中均有表达,主要定位于腺上皮细胞质内;LC3主要定位于腺上皮细胞和间质细胞的细胞质内;NF-κB免疫阳性显色呈现棕黄色,腺体细胞和间质细胞中均有表达,主要定位于腺上皮细胞的细胞质内,胞核中偶见少量表达(见图4,5)。

图4 各组大鼠在位内膜中FoxO1、Beclin-1、LC3及NF-κB的定位表达情况Figure 4 Localization and expression of FoxO1、Beclin-1、LC3 and NF-κB in eutopic endometrium of rats in each group

图5 各组大鼠异位灶中FoxO1、Beclin-1、LC3及NF-κB的定位表达情况Figure 5 Localization and expression of FoxO1、Beclin-1、LC3 and NF-κB in ectopic foci of rats in each group

2.6 各组大鼠在位内膜和异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子蛋白水平的比较

与假手术组的在位内膜相比,模型组在位内膜的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的蛋白含量明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组和西药组的在位内膜FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II蛋白含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(见图6)。与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组和西药组异位灶FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II蛋白含量明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(见图7)。

图6 各组大鼠在位内膜中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子蛋白含量Figure 6 Protein contents of FoxO1,NF-κBand autophagy related factors in eutopic endometrium of rats in each group

图7 各组大鼠异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子蛋白含量Figure 7 Protein contents of FoxO1,NF-κB and autophagy related factors in ectopic lesions of rats in each group

2.7 各组大鼠在位内膜和异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的比较

与假手术组的在位内膜相比,模型组在位内膜的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-IImRNA表达均增高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,中药高剂量组、中药低剂量组和西药组的在位内膜FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)(见表3)。

表3 各组EMs大鼠在位内膜中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的比较(±S)Table 3 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in eutopic endometrium of EMs rats in each group(±S)

表3 各组EMs大鼠在位内膜中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的比较(±S)Table 3 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in eutopic endometrium of EMs rats in each group(±S)

组别Groups FoxO1 Beclin-1 LC3-I LC3-II NF-κB假手术组Sham operation group 0.74±0.25 1.27±0.71 1.31±0.78 1.03±0.61 1.22±0.64模型组Model group 1.14±0.48* 2.21±0.96* 2.96±0.83** 1.74±0.54* 2.24±0.72*中药高剂量组High dose group 0.86±0.29▲ 1.21±0.45▲ 1.20±0.42▲ 0.81±0.42▲ 0.90±0.37▲中药低剂量组Low dose group 0.91±0.37▲ 1.96±0.89▲ 1.56±0.87▲ 1.56±0.73▲ 1.76±0.89▲西药组Western medicine group 0.60±0.21▲▲ 0.87±0.47▲ 0.81±0.31▲▲ 0.57±0.23▲ 0.69±0.34▲

与模型组相比,中药高剂量组和西药组异位病灶中FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01);中药低剂量组异位病灶的Beclin-1、LC3-I及LC3-II mRNA表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05);FoxO1、NF-κB mRNA的表达也呈现降低趋势,但与模型组相比差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表4 各组EMs大鼠异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的比较(±S)Table 4 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in ectopic foci of EMs rats in each group(±S)

表4 各组EMs大鼠异位灶中FoxO1、NF-κB及自噬相关因子mRNA的比较(±S)Table 4 Comparison of FoxO1、NF-κB and autophagy related factor mRNA in ectopic foci of EMs rats in each group(±S)

组别Groups FoxO1 Beclin-1 LC3-I LC3-II NF-κB模型组Model group 1.38±0.17 1.07±0.34 1.15±0.14 1.58±0.20 1.44±0.19中药高剂量组High dose group 0.68±0.12* 0.54±0.21* 0.43±0.16** 0.71±0.23* 0.69±0.29*中药低剂量组Low dose group 1.00±0.34 0.61±0.24* 0.63±0.25* 1.17±0.39* 0.81±0.25西药组Western medicine group 0.22±0.03** 0.14±0.05** 0.11±0.03** 0.49±0.19** 0.29±0.09**

2.8 NF-κB与FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的相关性分析

用SPSS 26.0统计软件进行相关系数检验,将NF-κB分别与FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II进行相关性分析后表明,FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II与NF-κB均呈显著正相关,相关系数(r)依次为0.905,0.914,0.918,0.931(P<0.01)(见图8)。

图8 NF-κB与FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II的相关线性表达Note.A.Correlation analysis of NF-κB and FoxO1.B.Correlation analysis of NF-κB and Beclin-1.C.Correlation analysis of NF-κB and LC3-I.D.Correlation analysis of NF-κB and LC3-II.Figure 8 Linear expression of NF-κB was correlated with FoxO1,Beclin-1,LC3-I and LC3-II

3 讨论

EMs属于中医“癥瘕”“痛经”“月经不调”“不孕”等范畴,基本病机为“瘀血内阻冲任、胞宫”,肾虚为本,血瘀为标,属本虚标实之证[12]。依据中医“审因论治、治病求本”的治则,多在活血化瘀的基础之上,以脏腑气血为纲,辨证施治,补肾温阳化瘀方具有补肾温阳,化瘀行滞之功。方中元胡除风邪,调节气血;肉桂、吴茱萸补肾温阳,散寒止痛,可破血通行,祛除腹中之寒气;小茴香、制附子温机体之阳气,畅通经脉,祛寒止痛;川芎行气活血,桑寄生补益肝肾等,全方标本兼治,能够改善患者疼痛症状,提高生活质量,并能够调节患者紊乱的生殖激素水平、抑制血管的生成,改善乏氧状态,从而抑制EMs的发展[13-15]。近年来发现,EMs细胞自噬功能的异常是机体阴阳失衡的微观表现[16],是探讨中医药微观机制的新思路,这为从细胞自噬角度探索补肾温阳化瘀方治疗EMs的作用机制提供了理论上的支持,也是实现中医药现代化的有效途径。

细胞自噬即“自我吞噬”,是真核生物进化过程中的一个高度保守的过程,主要发生于细胞质中,利用溶酶体进行自我清除和降解自身受损的细胞器,以维持细胞生命活动及机体内稳态[17]。自噬以其特异的清除和代谢功能与中医理论的对立制约、互根互用、追求阴阳平衡的内涵不谋而合[18]。自噬就是在阴阳消长过程中维持着机体微观的平和,其太过或不及都可能引起机体的阴阳失衡,导致疾病的发生。有研究表明自噬与EMs的发生发展密切相关,但结论不一。有学者报道EMs患者的异位内膜的自噬水平是下降的[19],也有学者认为EMs的发展中其自噬水平是增高的[20]。由此可见,自噬在EMs进展的过程中可能呈现一个动态变化的过程,

其发生受到多种相关信号通路的严密调控。其中,FoxO1在细胞自噬调节过程中起着不可或缺的重要作用,通过其乙酰化/去乙酰化、磷酸化/去磷酸化过程的特异性调节[21]影响细胞自噬的水平[22]。NF-κB广泛参与机体炎症、细胞自噬等生理病理过程[5],活化的NF-κB诱导炎症因子产生的同时也引起自噬调控关键因子微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的聚集和Beclin-1的泛素化,进而激活细胞自噬[23],加速疾病的发展进程。本研究通过比较模型组和假手术组大鼠大体一般状态、机械痛阈值及脏器系数等变化,判定成功建立了肾阳虚血瘀型EMs模型,补肾温阳化瘀方治疗后能明显改善以上指标。通过免疫组化、PCR及Western Blot等多种实验方法发现,模型组在位内膜及异位灶的FoxO1、NF-κB、Beclin-1、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ的表达均明显高于假手术组,又通过相关性分析发现NF-κB与FoxO1、Beclin-1、LC3-I及LC3-II在EMs在位内膜中的表达呈正相关,结果提示在EMs发展中异常表达的FoxO1可能通过刺激NF-κB的活化,促进炎症因子的增加,诱导了细胞自噬水平的升高,为“异位”的内膜细胞提供了物质能量,使其容易在异位处存活,进一步侵袭、发展、扩散,细胞自噬稳态失衡无法维持内环境的稳定,血脉运行受阻,血不归经,瘀积成癥,日久伤阳,使机体阴阳失衡。经过补肾温阳化瘀方治疗后在位内膜及异位灶的FoxO1、NFκB、Beclin-1、LC3-Ⅰ及LC3-Ⅱ水平明显降低,表明补肾温阳化瘀方可能通过降低FoxO1的含量,减少NF-κB的活化,减轻局部炎症反应,抑制了细胞自噬水平,改善细胞内部微环境,温阳益肾以扶正,活血祛瘀以祛邪,共奏平衡阴阳之效,从而发挥有效治疗EMs的作用。

综上所述,由于多种复杂因素的共同参与,使得EMs的子宫内膜组织中FoxO1表达上调,而FoxO1的活化引起NF-κB的过度表达,进而增强了细胞自噬的水平,使子宫内膜的性状发生了改变,加剧了EMs盆腹腔缺血缺氧的微环境,进一步刺激FoxO1的表达增加,使FoxO1、NF-κB、自噬机制进入正反馈循环,“异位”内膜不断浸润,久则瘀血无所出路,阻滞冲任、胞宫,阳气推动无力,使得实邪持续存在并愈加严重,日久成癥,进一步损伤人体之阳,加重机体阴阳失衡,加速EMs的发展进程。中医药在治疗EMs过程中以调整阴阳平衡,扶正祛邪为主,贯彻“谨察阴阳所在而调之,以平为期”的论治思路。补肾温阳化瘀方能够抑制在位、异位内膜中FoxO1的表达,减少NF-κB的激活,降低细胞自噬水平,一方面抑制能量供应使得异位内膜种植生长过程中的营养物质供应不足而萎缩,另一方面自噬能力的不足可导致细胞耐受缺血缺氧的能力下降从而使细胞死亡。本方具有活血化瘀之功,使瘀血之邪得以消散,离经之血得以归经;同时温阳补肾,使“血得温则行”,通过充盈自身正气而祛邪,进而调整机体的阴阳相对平衡,恢复“阴平阳秘”的状态,缓解症状,最终达到改善EMs的目的。