神经重症医学科感染患者非多重耐药肺炎克雷伯菌的毒力基因分布与传播特征分析

元小冬，张萍淑，刘妍，李妍，耿贺梅，王贺永，张淑清，刘青

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是神经重症医学科（Neurological Intensive Care Unit，NICU）患者感染的主要病原菌，多见于呼吸道、泌尿道、血液感染［1-2］。近年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP）逐渐增多，全球耐药率达20%～70%，其耐药基因可由质粒介导，通过转化、接合、转导等形式传递，进而形成多重耐药菌［3］，目前关于KP的毒力基因特征已成为临床的研究热点。全基因组测序技术（whole genome sequencing，WGS）能够直接反映基因组DNA的遗传信息，对确定耐药基因型、预测细菌耐药表型的特异度、灵敏度较高，能够较全面地了解病原菌来源、感染、耐药、传播等机制［3］，为本课题组对细菌基因组中携带毒力基因与其临床致病机制的关系研究提供了有力的技术支撑。本课题组在NICU感染患者中筛选出具有特定同源关系的非多重耐药KP进行全基因组测序，并应用多种生物信息学软件在全基因组测序中筛选出其携带的毒力基因，进而分析其分布和传播特征，以期为KP感染的防控提供依据。

1 资料与方法

1.1 样本来源 收集2015—2018年开滦总医院收治的93例NICU感染患者的非多重耐药KP 94株。所有KP应用K-B法进行抗菌药物敏感试验及脉冲场凝胶电泳法（PFGE）进行同源性分析，将相似度为100%视为同一克隆株，相似度≥80%视为同一流行克隆系［4］。选出其中的无同源性KP 3株，即2015年、2016年、2017年各1株，分别编号为P20、P39、P66；2018年，选出与P66为同一流行克隆系的KP 2株，分别编号为P90、P91，且P90与P91为同一克隆株。

1.2 WGS 将5株非多重耐药KP进行二代、三代全基因组测序，将所得的基因组测序结果上传至NCBI的prokaryotic annotation pipeline系统，进行基因组预测基因注释，并应用BLAST软件进行对比分析，获取病原菌毒力因子数据库（Virulence Factors Datebase，VFDB），比对基因注释结果，筛选条件：一致性＞80%，E值＞0。

2 结果

2.1 NICU感染患者的临床特征 在选出的5例NICU非多重耐药KP感染患者中，男4例，女1例；年龄50～76岁，平均（66.0±10.5）岁；疾病类型：肺炎4例、肺炎+泌尿系统感染1例；抗生素（青霉素类/头孢类/大环内酯类）用药种类：1种3例，≥2种2例；侵入性操作：泌尿道插管5例、鼻饲营养3例、呼吸机通气2例、气管插管2例、动静脉插管1例、气管切开1例。

2.2 NICU感染患者非多重耐药KP的毒力基因类型 将NICU感染患者5株非多重耐药KP的基因组测序结果与VFDB进行比对，结果发现，在5株非多重耐药KP中共筛选出6大类52种毒力基因，其中黏附类17种（32.7%）、铁吸收类15种（28.8%）、分泌系统类15种（28.8%）、调节类3种（5.8%）、内毒素类1种（1.9%）、侵入类1种（1.9%），其中P20携带19种（36.5%）、P39携带18种（34.6%）、P66携带2种（3.8%）、P90携带47种（90.4%）、P91携带49种（94.2%），见表1。

表1 NICU感染患者非多重耐药KP的毒力基因类型〔n（%）〕Table 1 Toxicity gene type of non-multiple-resistant KP in patients with NICU infection

2.3 NICU感染患者非多重耐药KP的毒力基因注释结果NICU感染患者非多重耐药KP的基因注释结果显示：（1）黏附类毒力基因：P90、P91中均检出fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI、ecpB、ecpE、ecpR、mrkA、mrkB、mrkD、mrkF、yagZ/ecpA、fliY基因各1个，P20、P39中仅检出1个fliY基因，P66未检出此类毒力基因。（2）铁吸收类毒力基因：在同一克隆株P90、P91中均检出fepB、fepC、fepD、fepG、entA、entB、entS、iroE、ybtA、ybtX、sitB、sitC基因各1个，P90还检出1个ybtT基因，其同一流行克隆系P66检出iucB、iroC基因各1个，P20、P39均未检出此类毒力基因。（3）分泌系统类毒力基因：P20、P39、P90、P91中均检出ECS88-3547、pulB、pulD、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS基 因 各 1个，P20、P90、P91均检出1个EC55989-3327基因，P20、P39、P91均检出pulC、pulG基因，P91检出1个EC55989-3335基因，P66未检出此类毒力基因。（4）调节类毒力基因：P20、P39、P90、P91中均检出fur、PMI0229基因各1个，P90、P91还各检出1个phoP基因，P66未检出此类毒力基因。（5）在P20、P39、P90、P91中均检出1个内毒素类毒力基因（kdsA基因）和1个侵入类毒力基因（Z1307基因）。

2.4 NICU感染患者非多重耐药KP毒力基因表达的毒力因子 NICU患者非多重耐药KP全基因组中，黏附类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大肠杆菌菌毛 ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）；铁吸收类毒力基因表达的毒力因子包括肠杆菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶尔西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、气杆菌素（iucB）、沙门菌素（iroC、iroE）、铁/锰酶转运（sitB、sitC）；分泌系统类毒力基因表达的毒力因子包括Ⅱ型分泌系统（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）； 调 节 类毒力基因表达的毒力因子包括Fur（fur）、PhoPQ（phoP）、ABC转运蛋白通透酶（PMI0029）；内毒素类毒力基因表达的毒力因子为LOS（kdsA）；侵入类毒力基因表达的毒力因子为OmpA（Z1307）。

3 讨论

KP是引发NICU患者呼吸道感染的主要病原菌，可通过克隆形式在病房环境和患者中传播和定植［5］。KP感染的发病机制较复杂，与其携带的毒力基因激活后表达的毒力因子有关，其主要毒力因子及其传播形式目前尚不完全明确。

本研究将NICU感染患者5株非多重耐药KP的基因组测序结果与VFDB进行比对，结果发现，5株非多重耐药KP中共筛选出52种毒力基因，其中P20携带19种（36.5%）、P39携带18种（34.6%）、P66携带2种（3.8%）、P90携带47种（90.4%）、P91携带49种（94.2%），可见NICU感染患者的非多重耐药KP基因组（P90、P91）中存在着大量的毒力基因。本研究结果还显示，NICU感染患者的非多重耐药KP全基因组中检出6大类共52种毒力基因，其中黏附类毒力基因最多，为17种（32.7%），主要毒力因子包括Ⅰ型菌毛（fimA、fimB、fimC、fimE、fimF、fimG、fimH、fimI）、Ⅲ型菌毛（mrkA、mrkB、mrkD、mrkF）、大肠杆菌菌毛ECP（ecpB、ecpE、ecpR、yagZ/ecpA）、腹膜鞭毛AⅠ139（fliY）。Ⅰ型菌毛和Ⅲ型菌毛黏附于宿主黏膜表面或与宿主细胞进行充分接触是导致KP感染的首要环节［6］，其中Ⅰ型菌毛能够穿过KP荚膜基质向外延伸，并调节细菌对宿主上皮细胞的D-甘露糖-敏感性黏附［7］；Ⅲ型菌毛可使KP牢固地黏附于人体呼吸道、消化道和泌尿生殖道等部位的黏膜上皮细胞，并促使KP在宿主表面形成生物被膜，其中fimH、mrkD基因分别编码Ⅰ型和Ⅲ型菌毛黏附因子［8-10］，可见KP携带的大量黏附类毒力基因是使其黏附、固定于患者各腔道部位上皮细胞并促进生物被膜形成而致病的重要遗传学基础。

本研究结果还发现，NICU感染患者的5株非多重耐药KP携带的铁吸收类毒力基因多达15种（28.8%），主要毒力因子包括肠杆菌素（entA、entB、entS、fepB、fepC、fepD、fepG）、耶尔西菌素（ybtA、ybtT、ybtX）、气杆菌素（iucB）、沙门菌素（iroC、iroE）、铁/锰酶转运（sitB、sitC）；分泌系统类基因表达的毒力因子包括Ⅱ型分泌系统（T2SS）（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS）（EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547）。研究表明，铁是细菌生物代谢、电子传递等生命活动中重要的氧化还原催化剂［11］。KP无法在宿主内直接获得铁元素，其主要通过分泌铁载体来获取，而铁载体是细菌分泌的高亲和力的胞外铁离子螯合剂，可与宿主铁结合蛋白释放的Fe3+相结合。肠杆菌素作为肠杆菌科细菌产生的一种邻二苯酚盐型铁载体蛋白，与铁具有较高的亲和力，主要通过结合血浆转铁蛋白中的铁来促进细菌生长［12］，且KP肠杆菌素合成基因entB的表达还可促进其生物被膜成熟。另外，耶尔西菌素作为混合型铁载体蛋白，与铁具有中等亲和力［13］，其可在机体缺铁状态时激活外膜蛋白FyuA来促进KP生物被膜形成；气杆菌素是一种氧肟酸盐与羧酸盐混合型铁载体，与铁亲和力不高，但其可高效利用其他细菌合成的气杆菌素而发挥作用［14］。耶尔西菌素、气杆菌素均可阻断活性氧产生，间接降低宿主先天免疫细胞的灭菌能力。沙门菌素及其受体iroN均是由基因簇iroA（iroBCDN）编码合成，其是一种邻苯二酚盐型铁载体，具有较高的铁亲和力，沙门菌素螯合铁可促进细菌复制而导致细菌感染的发生发展［15］，其特征性的抗氧化剂作用还可催化产生羟自由基，进而加重组织损伤，增强细菌的致病力。因此，KP携带的铁吸收类基因表达的毒力因子在促进细菌生长、生物被膜成熟、加重组织损伤、感染传播等方面具有重要作用。

研究表明，细菌的分泌系统可通过跨膜转运特定的生物大分子实现分泌毒力蛋白等各种生物因子，以适应环境的变化，进而使细菌在宿主内定植、繁殖、扩散而致病［16］。目前在革兰阴性菌中已经发现了9种蛋白分泌系统，可根据分泌系统跨越内膜和外膜方式分为单膜镶嵌分泌系统和双膜镶嵌分泌系统，依据效应物的释放方式可将其分泌机制分为一步分泌机制和两步分泌机制［17］。本研究发现，NICU感染患者非多重耐药KP携带的分泌系统类毒力基因达15种，主要为Ⅱ型分泌系统（T2SS）和Ⅵ型分泌系统（T6SS），T2SS主要携带pul基因簇（pulB、pulC、pulD、pulG、pulH、pulI、pulJ、pulK、pulM、pulN、pulO、pulS），pul基 因 序 列 中pulC到pulO构成了一个独立操纵子，而pulB、pulS位于其附近，可将支链淀粉酶分泌蛋白转运到壁膜间隙，再由12～16个蛋白组成的精细分泌装置将其转运到细胞外，完成两步分泌机制的过程［18］。KP可以利用Ⅱ型分泌系统分泌毒力因子，还可为毒力因子生存提供必要的营养物质。本研究在KP检出的T6SS主要包括EC55989-3327、EC55989-3335、ECS88-3547基因，均属于双膜镶嵌分泌系统，是一种接触依赖性蛋白分泌装置，其效应物通过一步分泌机制直接从细胞质被靶定至细胞外或宿主细胞内，可在不同环境中产生细菌拮抗，将毒素注射到目标细胞中可避免KP受损、促进菌落的形成与定植，进而导致宿主感染［19-20］。因此，KP携带的Ⅱ型、Ⅵ型分泌系统类毒力基因表达合成的分泌蛋白不但可为自身提供生存保障，还可进一步损伤宿主细胞功能。

本研究结果显示，NICU感染患者的5株非多重耐药KP全基因组中，共检出调节类毒力基因3种、内毒素类毒力基因1种、侵入类毒力基因1种，调节、内毒素、侵入类毒力基因表达的毒力因子具有保护细菌逃避宿主的免疫杀伤、抵抗巨噬细胞吞噬及发挥损伤宿主细胞功能等作用［21］。同时，本研究结果显示，KP携带的黏附类毒力基因除表达为腹膜鞭毛AⅠ139因子的fliY基因外，其他仅存于以克隆传播的P90、P91中，提示黏附类毒力基因主要以克隆形式在KP中进行传播。同样，铁吸收类毒力基因也仅存于同一流行克隆系的P66、P90、P91中，其中肠杆菌素和耶尔西菌素类的合成基因主要存在于同一克隆株P90、P91中，而气杆菌素和沙门菌素类的合成基因主要存在于P90的同一流行克隆系P66中，因此铁吸收类毒力基因主要以同一流行克隆系形式在KP中进行传播。但并未发现KP携带的分泌系统类、调节类、侵入类、内毒素类毒力基因传播与KP的传代方式有明显关系。同时，本课题组发现同一克隆KP毒力基因类型明显多于同一流行克隆系KP，表明以克隆方式传代的KP具有更强致病毒力的遗传学基础，且黏附类和铁吸收类毒力因子是其致病毒力更强的主要原因。

综上所述，NICU感染患者非多重耐药KP中携带着大量的致病毒力基因，主要为黏附类、铁吸收类、分泌系统类毒力基因，还有少量的调节类、内毒素类、侵入类毒力基因。黏附类和铁吸收类毒力基因以克隆方式进行传播，这也是以克隆方式传代的KP具有更强致病毒力的遗传学基础。但本研究为单中心研究，样本量较少，同时缺少多重耐药菌的基因组对比分析，今后仍需多中心研究进一步完善相关分析。

作者贡献：元小冬、张萍淑、刘妍进行文章的构思与设计，进行结果分析与解释；张萍淑、刘妍进行研究的实施与可行性分析；刘妍、李妍、耿贺梅、王贺永、张淑清、刘青进行数据收集、整理、分析；元小冬撰写论文，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理；刘妍、李妍、刘青进行论文的修订。

本文无利益冲突。