多信息G1-熵权组合赋权法优选醋当归炮制工艺△

王慧楠，张桂梅，杨子烨，王佩华，陈梦雨，岳珠珠，姜明瑞，王志成，张婧秋，王英姿

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

当归是伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels 的干燥根，最早记载于《神农本草经》，具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效[1-2]。当归的炮制方法最早记载于《刘涓子鬼遗方》，自南北朝到清朝，历代古籍记载的炮制方法有多种，主要包括酒炙、清炒、土炒、醋制及其他炒法。

醋制是最常见、最有效的中药饮片炮制方法之一。中医药理论认为，醋性温，味酸、苦，入肝、胃经，能起到活血化瘀、散瘀止痛、疏肝行气的作用，也能入血分，有收敛气血、止血消肿的功效[3]。醋当归在古代应用广泛，艾煎丸、六一丸、小蓟饮子等均以醋当归入方来治疗血虚气滞、寒冷带下、月经失调等妇科疾病。现代药理研究也表明，醋当归在凝血方面具有显著的调节作用[4]，可用于治疗冻疮及崩漏带下、月经不调等妇科疾病。为了更加深入研究中药饮片醋制工艺，本研究以阿魏酸、醇浸出物以及体外凝血时间的综合评分为指标，考查炒制温度（A）、炒制时间（B）、米醋用量（C）及闷润时间（D）对醋当归炮制工艺的影响，采用G1-熵权组合赋权法计算各指标权重，以期丰富醋制炮制方法研究，为醋制中药炮制工艺优选提供新思路与新方法。

1 材料

岛津高效液相色谱仪（SIL-20A型自动进样器类型、SPD-20A 型紫外-可见检测器、CTO-10A SVP 型柱温箱）；DHG-9030A 型电热干燥箱（北京北方利辉实验仪器设备有限公司）；BSI10 型万分之一电子天平（Sartorius 公司）；HH-S4 型恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；KH7200DB 型超声清洗仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；MS-5 型炒货机（台州博大制药机械科技有限公司）；ZN-02 型粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；CA550 型凝血分析仪（日本Sysmex公司）。

米醋为恒顺镇江香醋（批号：6902007115180）；凝血功能检测所用的兔血浆购自上海源叶生物科技有限公司（批号：J01M10S81673）；乙腈、甲醇（赛默飞世尔科技有限公司，色谱纯，批号分别为164793、165503）；阿魏酸对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：110773-201614）；0.9%氯化钠溶液（石家庄石药有限公司，批号：1901013202）；凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）试剂（Sysmex，批号分别为R8038、R8034、48066）；实验用水为纯净水；其他试剂为分析纯。

当归饮片购自北京鹤延龄中药饮片公司，批号：DC5061，经北京中医药大学刘春生教授鉴定为伞形科当归属Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。

2 方法与结果

2.1 醇浸出物含量测定

以《中华人民共和国药典》2020 年版四部2201中浸出物测定法中的热浸法为测定依据，以70%乙醇为溶剂，测定供试品溶液中醇浸出物的含量[5]。

2.2 阿魏酸含量测定

2.2.1 对照品溶液配制 准确称取阿魏酸对照品4.98 mg，在25 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，得对照品储备液；然后准确量取对照品储备液1.5 mL，在50 mL 量瓶中加入70%甲醇，定容，摇匀，得到质量浓度为11.95 μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液[6]。

2.2.2 供试品溶液配制 取当归粉0.2 g（过三号筛），准确称取，置于50 mL 具塞锥形瓶中，再加入70%甲醇20 mL，称量，在80 ℃水浴加热条件下回流30 min，冷却，称质量，加入70% 甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，得到供试品溶液。

2.2.3 色谱条件 采用Agilent Extend-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-0.085%磷酸(17∶83)作为流动相；检测波长：316 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；进样时间：30 min；流速：1.0 mL·min-1。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 标准曲线绘制 准确称取阿魏酸对照品，配制成质量浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg·mL-1的系列对照品溶液，进样检测，以峰面积为纵坐标（Y），样品质量浓度为横坐标（X），回归方程：Y=67 997X+29 790，r=0.999 6。

2.2.4.2 精密度考察 准确称量2.2.1 项下对照品溶液10 μL，进样，连续测定6 次，阿魏酸峰面积的RSD为0.22%，表明该仪器精密度良好。

2.2.4.3 重复性试验 准确称量6 份同一批制备的醋当归粉，按照2.2.2 项下方法制备供试品溶液，取10 μL 注入高效液相色谱仪，计算出阿魏酸质量分数的RSD为2.46%，说明该方法重复性良好。

2.2.4.4 稳定性试验 准确称取同一批制备的醋当归样品粉，按照2.2.2 项下的方法制备供试品溶液，取供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、10、12 h连续进样1次，记录峰面积，计算阿魏酸峰面积的RSD为0.23%，说明该供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.2.4.5 加样回收率试验 准确称量6个已知指标成分含量的供试品，按比例1∶1准确加入阿魏酸对照品，按2.2.2项下的方法配制供试品溶液，取10 μL 进样，检测阿魏酸的含量，并计算回收率。结果显示，各样品中阿魏酸的加样回收率为99.78%～103.65%，平均加样回收率为101.74%，RSD为1.53%。

2.3 凝血功能考察

2.3.1 样品溶液配制 称取生当归和醋当归粉2.0 g，准确称质量，分别加入0.9%氯化钠溶液10 mL，超声30 min，4000 r·min-1离心5 min（离心半径为10 cm），取上清液过0.45 μm 微孔滤膜，得到质量浓度为0.1 g·mL-1的当归原液和质量浓度为0.13 g·mL-1的醋当归提取液。

2.3.2 凝血功能指标测定 精密量取生当归提取液和醋当归提取液150 μL，分别加入兔血浆350 μL，采用全自动凝血仪测定空白组、生当归组、醋当归组的PT、APTT、TT值[7]。

2.4 数据处理

2.4.1 G1 法主观赋权 据古籍记载和现有文献报道[4]，随着用法用量的不同，醋当归对凝血的调节作用会存在显著差异，因此，凝血功能指标与有效成分指标相结合能更直接地反映出醋当归饮片的质量与药效作用[8]。阿魏酸是醋当归的主要药效物质，具有良好的抗凝血作用，与醇浸出物相比，其含量、溶出率的变化与当归炮制后药效作用变化有更密切的联系[9-10]。因此，依据醋当归药效物质功效及凝血功能相关指标特征，将5 个评价指标顺序关系设定为PT＞APPT＞TT＞阿魏酸＞醇浸出物，并对相邻2 个指标的重要性之比进行赋值，依次为r2（y1与y2）=1.1，r3（y2与y3）=1.1，r4（y3与y4）=1.3，r5（y4与y5）=1.1，以rk为标准计算各指标的主观权重系数，按公式（1）计算[11]。

式中，rk=yk-1/yk，k=m，m-1，……，3，2。其中，wk表示主观权重系数，yk-1与yk为评价指标，rk为相邻2个指标的重要性之比。

2.4.2 熵权法客观赋权 数据标准化：假设一共有n个待比较的物体，k个特征数，某个特征一共n个特征值X1j，X2j，……，Xij，Xnj，对每个Xi都进行标准化处理[12]。

式中，X表示各指标成分的含量，Y表示各指标成分含量经标准化处理之后的数值。

按公式（3）每个样品的某个特征值在这个特征中所占的权重。

式中，r表示各指标成分含量经标准化处理之后的数值，f表示各指标成分的某个值在此指标成分所有值中所占的权重，n表示各评价指标的测量次数。

按公式（4）计算各特征的信息熵。

式中，f表示各指标成分的某个值在此指标成分所有值中所占的权重，s表示各指标成分的信息熵，n表示各评价指标的测量次数。

按公式（5）计算各特征的信息熵权重。

式中，s表示各指标成分的信息熵，w表示各指标成分的客观权重系数，m表示评价指标的个数。

2.4.3 组合权重的确定 综合权重按公式（6）计算。

式中，w1表示主观权重系数，w2表示客观权重系数。

2.4.4 归一距离评价法采用归一距离评价法对验证实验的数据进行处理，按公式（7）计算。

式中，di=(Ymax-Yi)/(Ymax-Ymin)，Y代表各指标成分的含量。

综合指标代表采用的实验方法距离最优值的距离，综合指标越接近0 表示各评价指标的工艺参数越优，优选出的炮制工艺越好。

2.5 正交试验

以炒制温度、炒制时间、米醋用量和闷润时间为因素，分别以醋当归中的阿魏酸、醇浸出物含量、PT、APTT、TT为评价指标，采用L9（34）正交设计，对醋当归的加工工艺进行优化，各指标因素水平设计见表1。

表1 醋当归炮制工艺正交试验优选的因素水平设计

将正交试验制备的醋当归饮片分别进行阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 的测定，采用更加客观公正的G1-熵权组合赋权法对含量进行分析，得出综合评分，对综合评分进行正交和直观分析，正交试验结果见表2～3，采用G1-熵权法计算各考察指标权重，结果见表4～5，实验安排和直观分析见表6。

表2 醋当归炮制工艺考察结果（±s,n=3）

表2 醋当归炮制工艺考察结果（±s,n=3）

表3 不同生当归和醋当归饮片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表3 不同生当归和醋当归饮片PT、APTT、TT值（±s,n=3）

表4 醋当归炮制工艺5种考察指标成分客观权重

依据表3 数据可知，生当归组的PT、APTT、TT值高于空白组，而醋当归组的PT、APTT、TT值部分高于生当归组，表明醋当归也可能表现出一定的抗凝血作用。由表5可知阿魏酸、醇浸出物、PT、APTT、TT的组合权重值依次为0.081 6、0.104 6、0.451 7、0.231 6、0.130 6，表明PT、APTT、TT 对醋当归饮片的质量影响较大。由表6 中的醋当归化学指标及抗凝血指标数据可知，各因素对醋当归饮片质量的影响顺序为C＞B＞A＞D，综合正交和直观分析可知，醋当归的最优炮制条件为A2B2C1D2，即每100 g 当归饮片加米醋15 mL，闷润1 h，150 ℃炒制20 min。

表5 醋当归炮制工艺5种考察指标成分的组合权重

表6 醋当归炮制工艺正交试验设计及直观分析

2.6 验证实验

取生当归饮片，按确定的醋当归炮制工艺参数进行炮制，测定阿魏酸、醇浸出物含量及PT、APTT、TT 值，结果见表7。由验证实验数据可知，平均指标为1.32，表明优选出的工艺参数合理，醋当归炮制工艺稳定可靠。

表7 醋当归炮制工艺验证结果（±s,n=3）

表7 醋当归炮制工艺验证结果（±s,n=3）

3 讨论

当归含有阿魏酸、挥发油、多糖、黄酮等化学成分[13]，主要被用来治疗血虚诸证，为妇科血病之圣药。古籍记载以醋当归入方可用于治疗寒冷带下、血虚气滞、月经失调、闭经痛经。APTT、PT、TT是反映内源性、外源性和共同凝血途径的常见指标[14-15]。本研究同时选用阿魏酸、醇浸出物含量、体外凝血时间（APTT、PT、TT）为考察指标，区别以往仅以有效成分为评价指标优选醋当归炮制工艺的方法，可更加全面、客观地评价炮制工艺的优劣。

各指标权重系数的确定是多指标评价中药饮片炮制工艺的重要问题。确定权重的方法有客观赋权法和主观赋权法，G1 赋权法是在层次分析法（AHP）基础上改进的一种主观赋权法[16]。熵权法是利用各指标所反映的信息量来确定权重的一种客观赋权法[11]。本研究采用G1 主观赋权法和熵权客观赋权法，综合了不同赋权法的优点，可全面准确地确定各个指标权重，使醋当归炮制工艺优选结果更为合理、可靠。

清代《本草述钩元》中记载了醋当归的使用用法和用量，“如吐衄崩下药中，须醋炒过，少少用之，多则反能动血”[17]。已有文献证实，醋当归能够促进凝血止血。本研究由于醋当归用量偏大，结果显示，醋当归具有一定的抗凝血活性，提示醋当归较高用量可能表现出抗凝血作用，与古籍记载一致。

炮制辅料醋含有醋酸、维生素、乙醇、乙醛、还原糖、氨基酸等成分，本身具有一定的药理作用。明代《本草蒙筌》中记载道“醋注肝，且资止痛”，说明中药经醋炮制后，可引药入肝经，增强其活血化瘀、祛瘀止痛、疏肝益气的功效[18]。现代研究也表明，醋制法是辅料醋与炮制中药相互作用进而导致中药化学成分或药理作用发生变化的一种复杂过程，可能通过增加有效成分的含量、溶出量或溶解度起到增加中药药效的作用[19]。当归经醋制后表现出一定的抗凝血活性，推测可能与阿魏酸等有效成分的提取率增加有关。

中医药理论认为，肝主藏血，主疏泄，有调节情志、调节气血、储藏血液的功能。女子以血为用，以肝为先天，易忧郁，郁则气滞血滞，故妇科疾病的发生多由肝经失调所致[20]。古今文献均表明，醋当归对月经不调、血虚气滞等妇科疾病具有很好的治疗效果，有一定的临床价值，可能与醋入肝经，炮制后可增强药物疏肝行气、化瘀止痛的功效有关[21]。但是目前关于醋当归的相关研究较少，因此，本研究通过正交试验设计，利用G1-熵权组合赋权法和多指标综合评分法优选了醋当归饮片的炮制工艺，结合凝血功能指标验证了优选出的醋当归炮制工艺稳定可行，对完善当归炮制理论、丰富醋制炮制法研究、传承中药传统炮制技术具有重要意义。