不同生长方式防风的HPLC特征图谱和体外抗炎活性比较研究△

李依林，薛雪，王海丽，韩婷，刘梦楠，魏锋，李向日*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.中药品质中心北京市重点实验室，北京 102488；

3.中国食品药品检定研究院，北京 100050

防风为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根，始载于《神农本草经》，被列为上品，味辛、甘，性微温，归膀胱、肝脾经，具有祛风解表、胜湿止痛、止痉的功效，主要用于治疗感冒头痛、风湿痹痛、风疹瘙痒、破伤风[1]。其主要含有挥发油类、香豆素类、色原酮类等成分，色原酮类成分是其发挥药效的主要物质基础，具有解热镇痛、抗炎及抗血小板聚集等作用[2]。

目前市场上流通的防风根据其生长方式大致分为3类，即野生防风、多年生栽培防风和1年生栽培防风。野生防风是自然界中自然生长的防风，在我国主产于黑龙江、吉林、内蒙古等地，在其他国家主要分布于蒙古国、俄罗斯等地。由于其在生长过程中没有人为干预，一般为3 年以上生，产量较低。栽培防风主产于我国内蒙古、黑龙江、吉林、辽宁、河北等地。由于黑龙江、内蒙古等地区气候寒冷，既有1 年生防风也有多年生防风，而河北安国等地防风栽培第二年出现抽薹，严重影响产量，因此所产均为1 年生防风。多年生栽培防风采用种子直播并选择粗放的方式管理，生长过程中没有人为干预，不施肥、不喷农药，多为2～6年生；1年生栽培防风仅生长1 年，且在种植过程中通过施肥、喷洒农药等进行人为干预。由于生长方式的不同，防风之间的质量差异也较大。本课题组前期研究发现，仅野生防风符合《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中对防风外观性状的规定，栽培品均不符合该规定，即《中国药典》2020 年版中并未收载栽培防风饮片的性状。然而，由于野生防风资源匮乏，现今在市场流通的主要是栽培品。作为1 味临床常用中药，防风质量直接影响到其临床疗效，栽培防风能否纳入《中国药典》值得研究[2-3]。

本研究对54 批不同生长方式防风的高效液相色谱法（HPLC）图谱进行研究，得到野生、多年生栽培品及1 年生栽培品的特征图谱，并通过特征图谱对其生长方式进行区分。抗炎作用是防风的主要药理作用之一，研究表明，防风可以通过抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7 释放一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子来发挥抗炎作用[4]。本研究采用脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子，对3 种生长方式防风体外抗炎作用效果进行比较，为防风质量控制及标准的制定提供参考，推动防风更好地用于临床疾病的治疗。

1 材料

1.1 仪器

FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；BT 125D 型电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；B-220 型电热恒温水浴锅（上海亚荣生化仪器厂）；Waters 2695 型高效液相色谱仪；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；SARTORIUS AG 型分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；SPECTRO star Nano 型全波长酶标仪（BMG Labtech 公司）；Form 311 型二氧化碳培养箱（Thermo Scientific公司）。

1.2 样品

共收集防风样品54 批（表1），产地分布于蒙古国、俄罗斯、中国黑龙江省、中国内蒙古自治区等地，分别为野生品12 批、多年生（2～6 年）栽培品16 批、1 年生栽培品26 批，其中3～12 号样品为防风饮片（批号分别为FF-YP-HM-15、FF-YP-HM-16、FF-YP-HM-17、FF-YP-HM-18、FF-YP-HM-19、FFYP-HM-20、FF-YP-HM-21、FF-YP-HM-22、FF-YPHM-23、FF-YP-HM-24），其余样品采集时为防风药材，前期已按照《中国药典》2015年版（四部）炮制通则项下净制和切制的方法炮制成饮片，3种防风饮片外观性状见图1。样品均为课题组人员亲自采集，经北京中医药大学李向日教授鉴定为伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata(Turcz.) Schischk.的干燥根。

表1 防风样品信息

图1 不同生长方式及生长年限防风饮片的外观性状

1.3 细胞

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 购于北京协和细胞库。

1.4 试剂

对照品升麻素苷（批号：0083-0025）、升麻素（批号：0084-0020）、5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号：0081-0025）、亥茅酚苷（批号：0969-0025）均购自成都普思生物科技股份有限公司，纯度均大于98.0%；防风对照药材（批号：120947-201409）购自中国食品药品检定研究院；LPS（Sigma 公司）；噻唑蓝（MTT，Amresco 公司）；肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA 检测试剂盒（Cloud-Clone 公司）；NO 检测试剂盒（BioDee 公司）；胎牛血清（Gemini公司）；DMEM高糖培养基（Corning-Cellgro公司）；青链霉素（Mediatech公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；娃哈哈纯净水。

2 方法

2.1 特征图谱

2.1.1 色谱条件 采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5 μm），检测波长为254 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为35 ℃，进样量为10 μL，流动相为甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～5 min，15%～35%A；5～15 min，35%A；15～20 min，35%～45%A；20～29 min，45%A；29～35 min，45%～55%A；35～41 min，55%～65%A；41～55 min，65%～76%A；55～65 min，76%A，65～70 min，76%～83%A）。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称定防风样品细粉约0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，水浴回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.1.3 对照药材溶液和对照品溶液制备 精密称定防风对照药材约0.25 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，称定质量，水浴回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。取对照品升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、亥茅酚苷各适量，加甲醇分别配制成质量浓度分别为0.320、0.120、0.280、0.033 mg·mL-1的溶液，作为对照品溶液。

2.1.4 精密度试验 取同一份供试品溶液（13号），重复进样6次，所测7个特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD均小于2%，符合要求，表明仪器精密度良好。

2.1.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液（13号），分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，所测7 个特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于2%，表明样品在24 h内稳定。

2.1.6 重复性试验 取同一批样品细粉6份（44号），按2.1.2 项下方法制备供试品溶液，进样测定，所测7 个特征峰的相对保留时间及相对峰面积RSD 均小于3%，表明方法重复性良好。

2.1.7 样品测定 按2.1.1 项下方法分别精密吸取对照品溶液、对照药材溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录54批防风的HPLC色谱图。

2.2 不同生长方式防风抗炎作用的比较研究

2.2.1 水提物的制备 分别称取野生防风饮片（3号）、多年生栽培防风饮片（24号）、1年生防风饮片（53号）各约5 g，分别置于圆底烧瓶中，加入水75 mL 回流2 h，滤过，取续滤液。滤渣再加入水75 mL 回流1 h，滤过，合并2次滤液，旋蒸干燥，得到水提物，提取率分别为21.40%、43.88%、44.66%。3 种水提物中升麻素苷、升麻素5-O-甲基维斯阿米醇苷以及亥茅酚苷4 种色原酮质量分数之和分别为4.22%、1.47%、0.92%。3 种水提物各精密称定约1 g，用DMSO溶解后，用DMEM 完全培养基稀释（DMSO体积分数为0.3%，对细胞无毒性作用），得到含水提物250 μg·mL-1的DMEM培养基。

2.2.2 细胞培养 RAW264.7 细胞加入含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM 高糖培养基，于含5%CO2、37 ℃培养箱中传代培养，隔天传代。

2.2.3 MTT 法检测3 种防风水提物对RAW264.7 细胞存活率的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，置于含5% CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h。对照组吸取上清液后每孔加入DMEM 完全培养基100 μL；各药物组的上清液分别换为含3 种不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培养基100 μL。每组均设3 个复孔，在培养箱继续培养24 h 后吸取上清液，每孔加入MTT 溶液10 μL，继续培养4 h，弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪上于490 nm检测吸光度（A）。实验重复3 次，按照公式（1）计算细胞存活率[5]。

2.2.4 3种防风水提物对LPS刺激的RAW264.7细胞NO、TNF-α释放的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于24 孔板，每孔500 μL，置于含5%CO2、37 ℃培养箱中孵育24 h。细胞贴壁后，弃上清液，用含3种不同水提物250 μg·mL-1的DMEM 完全培养基和含1 μg·mL-1LPS的DMEM 完全培养基处理，实验分为对照组、模型组（LPS 组）、野生组、多年生栽培组、1 年生栽培组。各药物组的给药方式为先加入对应的含药培养基500 μL，预处理1 h 后，吸去含药培养基，加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培养基500 μL，孵育24 h；模型组加入含1 μg·mL-1LPS 的DMEM 完全培养基500 μL，孵育24 h；对照组直接加入DMEM完全培养基500 μL，孵育24 h。每组3 个复孔。孵育结束后，收集上清液，利用试剂盒检测上清液中NO、TNF-α水平。

2.3 统计分析

数据采用SPSS 20.0统计软件处理，使用箱式图对各组内升麻素相对峰面积进行分析，剔除离群值；特征峰相对峰面积及RAW264.7 细胞NO、TNF-α释放的组间比较采用单因素方差分析或非参数检验。采用SIMCA 13.0 对3 种防风饮片特征图谱中特征峰相对峰面积进行偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。

3 结果

3.1 特征图谱

3.1.1 3 种生长方式防风特征图谱的建立 通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）生成不同生长方式及年限防风饮片的对照特征图谱（图2）。54 批样品特征图谱存在1、3、4～7 共6 个共有峰。此外，2 号峰为升麻素，其在非野生品中含量很小，有些批次甚至含量为0，而升麻素为防风的主要药效成分及入血成分，也是区分防风生长方式的重要指标[6]，与防风饮片的质量密切相关，故将2号峰与其他6个共有峰共列为特征峰。

图2 防风饮片HPLC特征图谱

3.1.2 不同生长方式防风特征图谱相对保留时间和相对峰面积 供试品色谱图中与对照特征图谱相对保留时间范围内一致的7 个特征峰，以5-O-甲基维斯阿米醇苷为参照峰，将其保留时间和峰面积均定义为1，计算54 批防风饮片特征峰的相对保留时间（表2）和相对峰面积（表3）。比较3 种不同生长方式防风7个特征峰相对峰面积，野生防风1、2、4、6号峰相对峰面积与多年生栽培防风和1年生栽培防风差异有统计学意义，多年生栽培防风1、5号峰的相对峰面积与1年生栽培防风差异有统计学意义，见表4。

表2 防风饮片7个特征峰相对保留时间

表3 防风饮片7个特征峰相对峰面积

3.2 不同生长方式防风特征图谱区别

3.2.1 野生防风与栽培防风的区别 SPSS 统计结果显示，编号为13、17、18 的3 个样品为异常值（图3）。通过SPSS非参数检验分析结果发现，2个异常值17、18 剔除前后野生防风饮片与多年生栽培、1年生栽培防风饮片中的2号峰（升麻素）的相对峰面积差异均有统计学意义（P＜0.05），结果未发生变化，故剔除2个异常值。剔除后野生防风饮片中2号峰相对峰面积极小值为0.15，多年生栽培、1年生栽培防风饮片中2号峰相对峰面积极大值为0.09。

图3 升麻素相对峰面积箱形图

3.2.2 多年生与1 年生栽培防风特征图谱的区别对多年生栽培与1年生栽培防风特征图谱的7个特征峰相对峰面积及不同相对峰面积的和进行PLS-DA，结果见图4 和表4。由图4 可知，42 批栽培防风中，除个别批次样品外，1年生栽培防风与多年生栽培防风基本可以分别聚为1类，表明其特征图谱相对峰面积具有差异。然而在所建立的PLS-DA模型中，累计解释能力参数R2X和R2Y分别为0.637和0.479，预测能力参数Q2为0.312，提示所建立的模型稳定性及预测能力较差，可能是由于2种栽培防风组内差异较大所致。

表4 3种不同生长方式防风特征图谱相对峰面积（±s）

表4 3种不同生长方式防风特征图谱相对峰面积（±s）

注：与野生组比较，***P＜0.001；与多年生栽培组比较，##P＜0.01。

图4 栽培防风饮片PLS-DA得分

3.3 体外抗炎作用比较

MTT 法检测结果显示，250 μg·mL-1时3 种提取物在24 h内对RAW264.7细胞生长无明显影响。3种防风对LPS 诱导RAW264.7 细胞NO 和TNF-α释放的影响结果见图5～6。与对照组比较，LPS 刺激显著增加RAW264.7 细胞中NO、TNF-α的产生。与LPS 模型组比较，3 种防风的提取物均显著抑制了细胞中NO、TNF-α的产生。野生防风提取物对NO和TNF-α产生的抑制作用最强。结果表明，防风提取物在体外均表现出抗炎作用，作用强度为野生组＞多年生栽培组＞1 年生栽培组，野生组与多年生组差异无统计学意义，而1 年生组作用与野生组和多年生栽培组差异均有统计学意义。

图5 3种防风水提物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞NO释放量的影响（±s,n=3）

图6 3种防风水提物对脂多糖诱导的RAW 264.7细胞TNF-α释放量的影响（±s,n=3）

4 讨论

4.1 不同生长方式防风特征图谱的研究

本研究采用梯度洗脱法分离防风中的成分，分离效果良好；通过二极管阵列（DAD）检测器全波长扫描得到在254 nm波长下吸收最高，故选择254 nm作为检测波长。流动相比较了甲醇-0.5%乙酸水系统与甲醇-水系统，发现甲醇-水梯度洗脱基线更加稳定且分离效果更好[7]。对防风的提取时间进行了考察，发现提取2 h 为最佳提取条件。在对HPLC 图谱的分析中发现，使用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012 版并不能对3 种不同生长方式的方法进行有效区分，因此，分别生成3 种不同生长方式防风的特征图谱后进行分析。对3 种防风的特征图谱进行比较发现，野生防风的多个特征峰相对峰面积与栽培防风差异有统计学意义，通过2 号峰即升麻素的相对峰面积就能够对野生防风与栽培防风进行区分。多年生栽培防风与1 年生栽培防风在相对峰面积上差异有统计学意义，在PLS-DA 中显示出2 种防风的差异。但同时多年生防风样品也表现出较大的组间差异，尤其是多年生栽培防风由于样品数量较少且产地与生长年限差别较大，如17、28 号等样品与其他样品间差异过大，对于多年生栽培防风的聚类影响较大。对栽培防风的特征图谱进行聚类分析发现产地对其的影响有待进一步研究。

本研究对采集的54 批不同生长方式防风进行了特征图谱研究，得到了野生、多年生栽培、1 年生栽培3 种不同生长方式防风的特征图谱，同时证实了升麻素含量是野生品与栽培品的主要区别指标，通过相对保留时间找到特征峰，再根据升麻素的相对峰面积可以准确区分野生品与栽培品。

4.2 不同生长方式防风体外抗炎作用的比较

NO 和TNF-α是体内重要的炎症因子，能够促进炎症反应[8]。对不同生长方式防风体外抗炎作用进行研究发现，3 种不同生长方式的防风在体外均可通过抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞分泌NO 和TNF-α发挥抗炎作用，其中野生防风和多年生栽培防风均有显著抑制2种炎症因子的作用，且2种防风作用效果差异无统计学意义；而1年生栽培防风对2种炎症因子的抑制效果不及前2 种防风，且与野生防风和多年生防风差异有统计学意义。即野生防风与多年生栽培防风抗炎作用效果相近且显著优于1 年生栽培防风。

本研究中多年生防风和1 年生防风在特征图谱上的区分不够明显，但在体外抗炎实验结果上区分明显，进一步说明防风的抗炎作用不仅与上述色原酮类成分有关，还可能与挥发油等成分有关。本课题组前期研究结果显示，多年生防风不仅外观性状接近野生防风，挥发油和色原酮等主要有效成分含量也与野生防风更加接近，而1 年生栽培防风在外观性状上与野生防风相去甚远，且整体成分组成与传统防风差异较大，与本实验中不同生长方式防风体外抗炎实验的结果一致。

防风作为一味临床常用中药，野生资源匮乏，现如今市场流通多为栽培品，质量参差不齐，1 年生防风充斥市场。因此，建议将多年生栽培防风纳入《中国药典》标准，并结合科学可靠的等级标准使防风能够更好地用于临床疾病的治疗。