肺吸入制剂非临床药代动力学研究的一般策略

陈美玲，黄亚军，姜德建，王小青（湖南省药物安全评价研究中心，新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，湖南普瑞玛药物研究中心有限公司，长沙 410331）

肺部给药也称吸入给药，是指运用特殊的装置，将药物通过呼吸运输至肺部，发挥局部或全身作用的一种给药方式[1-2]。与其他给药途径比较，因肺泡表面积大，膜通透性高，肺部酶活性低，肺吸入制剂药代动力学（pharmacokinetic，PK）具有以下特征：① 药物吸收迅速，无肝脏首过效应；② 药物在非靶器官的分布较低，可减少或避免药物对机体的毒副反应[3-7]。近年来，随着肺吸入制剂的快速发展，针对肺吸入制剂PK 研究的评价方法和手段也有了长足的进步。本文结合目前国内外相关研究进展，对肺吸入制剂非临床PK 研究的一般策略进行综述，为肺吸入制剂的研究开发提供支持。

1 肺吸入制剂非临床PK 研究的一般考虑

常用的肺吸入制剂主要包括定量吸入剂、干粉吸入剂、雾化吸入剂等[8-9]。定量吸入剂又称气雾剂，是指将药物与抛射剂装于耐压密闭容器中，借抛射剂将内容物喷出使用的制剂；干粉吸入剂又称粉雾剂，是指将药物或与载体的混合物置于吸入装置内，通过患者自主吸入的一种制剂；雾化吸入剂又称喷雾剂，是指将药物或与辅料置于特制装置中，借助手动泵压力、高压气体或超声振动将内容物释出使用的制剂。

与常规制剂不同的是，肺吸入制剂进入循环系统主要有两条途径：第一条为部分药物经肺部吸入后，经过黏液层、上皮细胞、基底膜、间质组织吸收入血；第二条为其余部分药物沉积于口腔，通过吞咽至胃肠道吸收入血。药物在肺部吸收的方式包括被动扩散、主动转运、细胞旁路转运、淋巴细胞吞噬等，一般来说，药物雾化后的粒径大小和理化性质对吸收方式及吸收部位有较大影响，如脂溶性较大的药物吸收方式主要为被动扩散[10-11]。

对于治疗肺部疾病的肺吸入制剂，其有效性主要取决于沉积在肺部的药物量，而其安全性需要考虑两个方面，包括局部安全性和全身安全性。由于肺部药物代谢与肝肠代谢存在较大差异，肺部酶活性普遍较低，且表达模式也不同，因此需要特别关注药物在肺部代谢物的暴露量、药物间的相互作用、以及药物是否可被肺部代谢酶活化等，以更好地评估其治疗效果或毒性反应。

2 肺吸入制剂非临床PK 研究的关注点

2.1 动物种属的选择

肺吸入制剂的非临床PK 研究一般采用健康、成年的动物进行。在考虑与人体PK 性质相关性的前提下，尽可能选择与毒理学和药效学研究相同的动物。创新性药物应选用两种或两种以上的动物，其中一种为啮齿类动物，另一种为非啮齿类动物。其他药物，可选用一种动物，建议首选非啮齿类动物。大鼠是肺吸入制剂非临床PK 研究中最常用的动物，尤其在研发初期，可用于候选药物的筛选、剂量设计等。例如，孙杰等[12]利用大鼠考察吸入与注射给予妥布霉素后体内药物的分布情况及毒性反应。非人灵长类动物（如食蟹猴）因其与人类在免疫学和解剖学上的相似性，也被用于开展一些特殊吸入制剂（如生物大分子）的非临床PK 研究。有研究显示，与啮齿类动物相比，猕猴吸入给予西妥昔单抗时生物利用度更低[12-13]。此外，小鼠、兔等实验动物也可用于肺吸入制剂的非临床PK 研究。

2.2 给药准确性的监测

为了确保在吸入给药时递送药物的准确性，在给药期间需对药物递送剂量、递送均一性和稳定性及空气动力学粒径分布进行监测[14-20]。在非临床研究阶段，通常在正式给药前需对雾化生成方法及含量检测方法进行考察和验证。

2.2.1 递送剂量的监测[21-24]肺吸入制剂的非临床PK 研究通常采用吸入染毒暴露系统进行。对吸入染毒系统进行参数设定，调整气溶胶流量及稀释气流量，可雾化产生不同浓度的药物颗粒。通过采样瓶或合适的滤膜采集一定时间内任意雾化通道雾化后的气溶胶颗粒（一般连续多次采集）并通过高效液相色谱仪等方法检测采样瓶或滤膜中的药物浓度，换算成气溶胶中的药物浓度，即可获得一定雾化时间内的药物剂量。对于液体制剂（气雾剂和喷雾剂），通常采用高效液相色谱法、气相色谱法等方法检测有效成分的含量。对于无挥发性的单一化合物，可采用称重法进行气溶胶浓度的检测。经济合作与发展组织（OECD）对液体和固体型气溶胶浓度的允许偏差为±20%[13]。

2.2.2 递送稳定性和均一性的考察 肺吸入制剂在吸入染毒系统持续雾化一定时间后，通过间断采样和检测，可考察持续雾化的稳定性。通过对雾化通道进行分通道采样，采集多个通道的样品进行检测，可考察各雾化通道间的均一性。对于多层的小动物单浓度口鼻动态暴露吸入染毒系统，还需对各层雾化通道进行分通道采样和检测，以考察各层雾化通道间的均一性。雾化后各时间点和各通道的药物浓度均应在目标浓度的±20%范围内。

2.2.3 空气动力学粒径分布的监测 气溶胶中药物颗粒的粒径分布是影响药物在呼吸道和肺部沉积的关键参数，因此，空气动力学粒径分布是给药过程中质量控制的重要指标之一。测试方法主要有碰撞法、激光衍射法和飞行时间粒径分析法，前两种方法较为常用[25]。临床上，FDA 建议采用至少两种原理的检测方法进行空气动力学粒径分布的研究，且其中一种必须采用多级碰撞法。碰撞法是目前吸入制剂体外粒度分析最经典的方法，也是美国和欧洲药典评价吸入制剂体外粒度分布推荐使用的方法。比如《中国药典》收载的双层液体碰撞器，美国、欧洲药典收载的Andersen 多级撞击器、Marple miler 多级撞击器等。近年来，新一代多级惯性碰撞器使用普遍，质量中值空气动力学直径和标准偏差等常用来作为评价参数。

2.3 体内暴露量的检测

生物样品的分析方法包括色谱法、免疫学法、放射性同位素标记法和微生物学方法等。其中色谱法包括高效液相色谱法、气相色谱法和色谱-质谱联用法；免疫学法包括放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶免疫分析法等。由于生物样本药物浓度低、样品量少、内源性物质干扰多且个体差异大，应根据药物的性质、生物样品中药物的浓度选择不同的检测方法。

进行组织分布研究时，除采集心、肝、脾、肾、脑等主要组织器官外，还需关注呼吸系统组织器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含会厌）、主气管、支气管、肺脏及肺灌洗液中药物的分布。胡文晋等[26]在研究雾化吸入羟基喜树碱后药物在肺癌小鼠中的组织分布中发现，肝脏、心脏、肾脏在给药30 min 后总碱药物达到峰值，其中肝内浓度最高，而肾和心的总碱分别占肝内峰浓度的33.8%和74.2%。

在血浆PK 和组织分布的研究中也会广泛运用到微透析技术，不仅可以减少实验动物的剖杀，而且微透析的样品无需匀浆，样品中不含大分子物质，无需前处理，可极大地节约时间成本[27-28]。例如，任亚超[28]在盐酸氨溴索干粉吸入剂的研究中利用微透析技术得出盐酸氨溴索干粉吸入剂能被运输到靶部位，与静脉给药相比，可达到更高的局部活性、持续更长的时间。

在进行药动学参数计算时，因为吸入制剂给药途径特殊，需先按实验动物体质量计算每分钟通气量RMV＝0.608m0.852（m是实验动物的体质量，单位为kg），再计算实际给药剂量D＝（给药时长×气溶胶中药物浓度×通气量×IF）/平均体质量（IF为可吸入颗粒的百分数，当气溶胶中有90%以上的颗粒粒径小于7 μm 时，IF＝1），最后用实际给药剂量计算药动学参数[29]。常见药动学参数详见表1。

表1 常见药动学参数汇总

3 体外PK 研究方法的应用

整体动物PK 研究固然能较为全面、系统地对肺吸入制剂进行评价，但其需要配套的动物设施设备、吸入染毒系统，且费时费力。在研发早期或因条件受限，无法开展系统的非临床PK 研究的情况下，研究者们也会运用体外方法进行研究。

3.1 离体脏器的应用

在研究相关机制时，更多地会采用动物离体脏器。例如，Eriksson 等[30]利用大鼠离体肺单向灌注模型（IPRL）研究沙丁胺醇、沙美特罗等十余种药物的离体渗透性，采用计算机模拟技术建立生理吸收模型，并与体外细胞模型结合，经校正后用于预测药物肺部吸收。此外，在研究药物肺部渗透能力时，也会用到蟾蜍。例如，Chen等[31]利用离体蟾蜍肺构建给药池-肺-接收池模型，研究脂质体的渗透能力。

3.2 酶系的应用

肺部药物代谢酶主要分布在Ⅱ型细胞中，种类齐全，含量低，主要是细胞色素P450（CYP），其大部分位于Clara 细胞的内质网上，且具有底物特异性[32]。肺部药物代谢与肝肠代谢存在较大差异，肺部酶活性普遍较低，且表达模式也不同。肺部常见的CYP 酶为CYP1B1、CYP2B6、CYP2E1、CYP2J2、CYP3A5 和CYP1A1，而肝脏中常见的CYP 酶为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6与CYP3A4。比如，CYP3A4 在肝脏中活性最高，而在肺组织较低。同时，因为肺部的代谢能力低，局部代谢产物难清除，新药研究过程中需关注肺部局部代谢物之间的毒性风险和相互作用，如可利用肺S9 筛选候选药物。肺部代谢酶还可活化部分药物，使其治疗效果更佳，如肺部酯酶可将丙酸倍氯米松代谢为更有效的17-倍氯米松单丙酸酯[33]。

3.3 细胞学的应用

Calu-3 细胞是一种非小细胞肺癌细胞，经培养可形成极化的单层细胞，细胞与细胞之间形成紧密连接，具有分泌黏液和表达囊性纤维化跨膜转导调节因子、各种离子通道等功能，无论是形态学还是功能上都与人体呼吸道上皮细胞类似。因此，Calu-3 细胞成为筛选肺吸入制剂的强大工具。肺癌细胞，如A549 细胞，既可作为抗肿瘤药物的靶细胞用于肺吸入制剂的药效学研究，又因其无限增殖、性状稳定等特点而被广泛用于细胞药物PK 研究。细胞模型的广泛应用，对肺吸入药物的作用机制、吸收转运途径、大分子药物的吸入有效性及细胞毒性等研究提供了较大便利[34-35]。

4 结语

非临床PK 研究在药物研发早期的有效性和安全性评价中有着举足轻重的作用，对于肺吸入制剂这种特殊的给药剂型，尽早开展PK 研究尤为重要。在欧盟，大多数的肺吸入制剂均以PK研究为基础而获批[36]。在涉及到前药或改变给药途径的前药时，需特别关注前药是否可以在呼吸系统转化成原药；在进行组织分布研究时，除常规的主要脏器外，还需重点关注呼吸系统组织器官如鼻咽（含鼻甲）、喉部（含会厌）、主气管、支气管、肺脏及肺灌洗液中的药物分布；在进行代谢研究时，需关注药物是否被肺部药物代谢酶所代谢，从而影响其生物利用度，并为代谢产物及其途径的鉴定设计提供参数。