知母配方颗粒中4种成分在大鼠体内的药动学研究

朱琳，毛梦倩，刘亮亮，刘珏玲（山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619）

知母为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎，始载于《神农本草经》，是常用中药复方的组成部分[1]。现代药理研究表明，知母提取物具有抗肿瘤、抑制血小板聚集、改善阿尔茨海默病症状、降脂、抗动脉粥样硬化、降血糖作用[2-8]。知母中的活性成分主要有甾体皂苷类、双苯吡酮类、木脂素类、黄酮类、多糖类等[9-13]，其中皂苷类成分像知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ被证实是治疗阿尔茨海默病、抗凝血、抗血栓以及抗癌的重要活性物质[4，6]。知母配方颗粒是本实验室课题组将知母饮片经水提醇沉、减压浓缩、冻干、制粒等工艺优化后制备而成的。然而，中药制剂的生产过程受多环节、多因素的影响，容易造成标准化程度不高、体内过程有差异等问题，进而导致临床药效的差异[14-15]。等效性研究是评价新剂型质量的重要方式，即通过测定血药浓度的方法来比较不同的制剂对药物吸收的影响，以及药物不同制剂之间的差异，以此来推测其临床治疗效果差异的可接受性。

本研究采用HPLC-MS/MS 法同时测定大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 种成分的血药浓度，并比较健康大鼠给予配方颗粒与饮片提取物后4 种成分的药动学行为差异，初步评价知母配方颗粒的生物等效性特征，为其临床合理用药及后续研究提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Exion LC AC 液相系统串联4000 Tripe Quad质谱仪（美国AB Sciex 公司）；XPE 105 十万分之一电子天平（瑞士梅特斯-托利多公司）；Sorvall ST 8R 高速冷冻离心机（美国Thermo Scientific公司）；AutoVap S60 型多样品浓缩氮吹仪（美国ATR 公司）；Analyst V1.5.2 工作站（美国AB Sciex 公司）。

1.2 试药

新芒果苷（批号：20190319）、芒果苷（批号：20181013）、知母皂苷BⅡ（批号：20190219）、知母皂苷AⅢ（批号：20190423）（纯度≥98%，成都克洛玛生物科技有限公司）；磺胺甲噁唑（批号：100025-201505，纯度≥98%，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙腈、甲酸（色谱纯，德国Fisher Scientific 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。知母购于国大药房晋中分店，经山西卫生健康职业学院生药教研室杨翠玲副教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根茎。

1.3 动物

雄性SD 大鼠12 只，体质量（200±20）g[山西卫生健康职业学院动物实验中心，许可证号：SCXK（晋）2019-0001]。饲养于普通环境中，室温20 ～30℃，相对湿度30%～70%，室内光照明暗交替12 h，普通饲料投喂，自由饮用净化水。

2 方法

2.1 色谱条件与质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Kinetex C18（75 mm×2.1 mm，2.6 μm）， 流动相为水（0.1%甲酸，A）-甲醇（0.1%甲酸，B），梯度洗 脱（0 ～1 min：90% ～68%A；1 ～5 min：68%～ 25%A；5 ～7 min：25%～10%A；7 ～8 min：10%A），流速0.4 mL·min－1，进样量2µL，柱温30℃。

2.1.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI 源），负离子方式扫描；离子喷雾电压－4500 V，离子源温度500 ℃；真空度（10 e－5）3.0 Torr；GS1、GS2与CUR 均为氮气，压力分别为40、40 和20 psi；扫描方式为多反应监测（MRM）；待测物离子通道及各参数数据见表1。

表1 待测物和内标的质谱条件Tab 1 Mass spectrometry condition of analyte and IS

2.2 系列混合对照品溶液的制备

分别取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ对照品适量，精密称定，加甲醇适量，制成质量浓度为1.0、3.0、3.0、1.0 mg·mL－1的待测物储备液。分别精密量取各储备液适量，用甲醇稀释成含新芒果苷（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 µg·mL－1），芒果苷（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 µg·mL－1），知母皂苷BⅡ（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 µg·mL－1）和知母皂苷AⅢ（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 µg·mL－1）的系列混合对照品溶液，4℃冰箱内保存，备用。

2.3 内标溶液的配制

取磺胺甲噁唑对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1.0 mg·mL－1的储备液。再精密量取储备液适量，加甲醇稀释成质量浓度为10.0 µg·mL－1的内标对照品溶液，4℃冰箱保存，备用。

2.4 大鼠灌胃给药溶液的制备

知母饮片：取知母饮片约60 g，称定，加入10 倍量30%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，过滤，滤渣再加8 倍量30%乙醇，回流提取1 h，过滤，合并两次提取液，减压浓缩至0.95 g·mL－1，备用。

知母配方颗粒：取实验室自制配方颗粒适量，加水溶解，制成质量浓度为0.95 g·mL－1（知母饮片含量）的溶液，备用。

2.5 血浆样品的采集

知母饮片组和配方颗粒组大鼠各6 只，给药前禁食12 h，期间自由饮水。两组分别灌胃给予知母饮片和配方颗粒灌胃液。于口服给药前和给药后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、36 h 大鼠眼眶静脉取血约0.5 mL，置于经肝素处理的离心试管中，摇匀后静置30 min，低速（4000 r·min－1）离心5 min，取上层血浆，于－80 ℃冰箱中冻存待测。

2.6 血浆样品的预处理

取大鼠空白血浆100 µL 置1.5 mL EP 管中，加甲醇10 µL，内标溶液10 µL，涡旋混合30 s 后，加乙腈100 µL，涡旋混合3 min，离心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液置另一1.5 mL EP 管中，氮气流吹干，残渣加初始比例流动相100 µL 复溶，涡旋1 min，离心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液，进样分析。

2.7 方法学考察

2.7.1 专属性 分别取6 份不同来源的大鼠空白血浆100 µL，按“2.6”项下方法操作（不加内标溶液），进样2 µL，得空白血浆样品色谱图（见图1a）；取线性最低点的标准溶液和内标溶液加入空白血浆，按“2.6”项下方法操作，得模拟血浆样品色谱图（见图1b）：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和IS 的保留时间分别为2.56、3.98、5.06、6.78 和3.67 min；取大鼠灌胃给予知母配方颗粒6.0 h 后的血浆样品，按“2.6”项下方法操作，得给药后血浆样品色谱图（见图1c）。结果表明，内源性物质以及代谢物不干扰血浆中待测物和IS 的测定，方法专属性良好。

图1 空白血浆（a）、空白血浆加待测物和内标（b）、给药6 h 后血浆加内标（c）的色谱图Fig 1 Chromatogram of a blank plasma sample（a），blank plasma spiked with analytes and IS（b）and plasma sample 6 h after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules（c）

2.7.2 标准曲线与定量限 取大鼠空白血浆100µL，加入待测物标准系列溶液10 µL，制备模拟血浆生物样品，除不加甲醇外，其余按“2.6”项下方法操作，每一浓度进行双样本分析，进样2µL，记录色谱图。待测物与内标峰面积比值为标准曲线纵坐标y，待测物质量浓度（ng·mL－1）为横坐标x，用加权（w＝1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得各组分标准曲线，结果见表2。

表2 新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的标准曲线参数和定量下限Tab 2 Linearity and LLOQ of neomangiferin，mangiferin，timosaponin BⅡ and timosaponin AⅢ

2.7.3 精密度和准确度 取大鼠空白血浆100µL，制备定量限、低、中、高4 个浓度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的浓度分别为1.0、2.5、12.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的浓度为10.0、25.0、125.0、800.0 ng·mL－1）的质控（QC）样品，每一浓度平行6 份，连续3 个分析批进样分析（不小于两天），计算QC 样品浓度。结果表明，4 种成分的日内和日间准确度的RE 分别小于10.3%和12.2%，日内和日间精密度的RSD分别小于11.4%和13.3%，符合相关要求。

2.7.4 提取回收率 取大鼠空白血浆上清液100µL，平行制备低、中、高3 个浓度的QC 样品各6 份进行分析，获得相应峰面积A；另取空白血浆100 µL，按“2.6”项下方法操作（不加内标溶液），向获得的上清液中加入低、中、高浓度的混合对照品溶液和内标溶液各10 µL，涡旋混合3 min 后于氮气流下吹干，以100 µL 初始流动相复溶。取2 µL 上清液进样，获得相应峰面积B。以峰面积比值（A/B）计算提取回收率。结果表明，各待测物提取回收率在80.2%～116.6%，RSD＜2.0%，符合相关要求。

2.7.5 基质效应 取不同来源的大鼠血浆样品100 µL，除不加内标溶液外，按“2.6”项下方法操作，向获得的样品中加入低、中、高3 个浓度的混合对照品溶液10 µL 和内标溶液10 µL，涡旋混合3 min 后于氮气流下吹干，以100 µL 初始流动相复溶，离心，取2 µL 上清液进样，获得相应峰面积；另取相应浓度的混合对照品溶液10µL 和内标溶液10 µL，涡旋混合3 min 后于氮气流下吹干，以100 µL 初始流动相复溶，取2 µL上清液进样，获得相应峰面积，上述每一浓度平行6 份。计算基质效应，各待测物基质效应稳定，在78.9%～109.7%，RSD＜15%。

2.7.6 样品稳定性 取大鼠空白血浆100 µL，制备低、高2 个浓度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的质量浓度分别为2.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的质量浓度为25.0、800.0 ng·mL－1）的QC 样品，平行制备3 份，考察样品在－80℃冻藏1 个月、3 次冻融循环、室温放置24 h 以及自动进样器放置（4℃）8 h 的稳定性。结果各待测物在上述条件下稳定性良好，RSD均＜10%。

2.8 样品测定和数据处理

血浆样品按“2.6”项下方法处理后分析测定。同时制备不少于当批样品总数5%的QC 样品（含低、中、高3 个浓度），将QC 样品均匀穿插于待测样品中于同一批进样分析。由QC 样品决定此分析批数据是否可用。采用非房室模型分别处理上述血药浓度测定数据，求算药动学参数（Phoenix WinNonlin 8.1）。其中达峰时间tmax和峰浓度Cmax为实测值；梯形法计算药时曲线下面积AUC；以血药浓度对时间作半对数曲线，以消除相最后4 点进行线性拟合，计算半衰期t1/2。

将得到的主要药动学参数（AUC0～t、AUC0～∞、Cmax）经对数转换后应用SPSS 20.0 进行独立样本t检验，其余参数（tmax、t1/2）应用SPSS 20.0 进行非参数检验，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 种成分的平均血药浓度-时间曲线见图2，主要药动学参数见表3。

表3 灌胃给药后知母配方颗粒与饮片后各成分的药动学参数(Mean±SD，n ＝6)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of 4 components in rat plasma after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces (Mean±SD，n ＝6)

图2 知母配方颗粒和饮片中4 种成分在大鼠体内平均血药浓度-时间曲线（n ＝6）Fig 2 Mean plasma concnetration-time curve of 4 active ingredient in the Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces in rats（n ＝6）

3 讨论

3.1 HPLC-MS/MS 条件的优化

新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ在电喷雾离子源正负离子检测模式下均有响应，但在正离子模式下响应较低，因此选择负离子检测。考察乙腈与甲醇作为有机相，结果用甲醇作为有机相时，各待测物的响应值较大，且背景噪音小，因此选择甲醇作为有机相。当流动相中加入甲酸后，色谱行为明显改善，随着甲酸含量的增加，各待测物的响应逐渐降低，最终选择0.10%甲酸浓度。

3.2 血浆样品处理方法的考察

血浆样品预处理中本研究考察了沉淀蛋白法和液液萃取法对各成分的影响，发现不同萃取剂下的提取效率都不是很好，而采用乙腈沉淀蛋白时较有效除去内源性杂质，且提取回收率较高，之后又考察了乙腈比例对提取率的影响，结果发现当空白血浆与乙腈比例为1∶1 时，回收率最高，因此选择乙腈（1∶1）沉淀蛋白法进行血浆样品预处理。

3.3 药动学结果

方差分析结果表明，健康大鼠分别灌胃给予知母配方颗粒和饮片提取物后，4 种有效物质的药动学参数均无显著性差异；经双单侧检验法分析，知母配方颗粒和饮片各成分的AUC比值在0.80 ～1.25，即ln0.80 ≤lnAUCT/AUCR ≤ln1.25，该置信区间在[ln0.80 ～ln1.25]，认为在90%的置信度下，两种剂型AUC具有生物等效性；知母配方颗粒和饮片各成分的Cmax比值在0.70 ～1.43，即Cmax比值为ln0.70 ≤lnCmaxT/CmaxR ≤ln1.43，该置信区间在[ln0.70 ～ln1.43]，可以认为在90%的置信度下，两种剂型Cmax具有生物等效性，实验表明新剂型和古方剂型之间生物等效，辅料和制备工艺对药方中有效成分无明显影响。

此外，芒果苷、知母皂苷BⅡ在两组大鼠体内均呈现双峰现象。双峰现象在一定程度上可延长药物在体内的作用时间，有一定的药理学意义，但更明确的作用机制有待进一步深入研究。

本研究建立了同时测定大鼠血浆中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ4 种成分的HPLC-MS/MS 方法，并对健康大鼠分别灌胃给予知母配方颗粒和饮片后4 种化合物的药动学行为进行了比较，结果表明，配方颗粒与饮片之间具有生物等效性，为知母配方颗粒的工业化生产及临床合理用药提供了一定的参考。