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一种氨肽酶N抑制剂抑酶活性检测试剂盒的开发

2021-09-04周奕婷徐鑫悦宋吉亮李玉天葛彬彬王森森房春燕王学健潍坊医学院药学院山东潍坊261053

中南药学 2021年8期
关键词:冻融底物孵育

周奕婷,徐鑫悦,宋吉亮,李玉天,葛彬彬,王森森,房春燕,王学健(潍坊医学院药学院,山东潍坊 261053)

氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是半静息态肝癌干细胞的生物标志物[1],增强APN 表达能促进肝癌干细胞存活。普通肝癌细胞单用化疗药氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理,APN上调,随之产生耐药性,合用APN 抑制剂乌苯美司(ubenimex)能明显增强5-FU、顺铂、阿霉素的细胞毒作用,减少肝癌肿瘤干细胞球形成[2-3],提示靶向抑制APN 对于肝癌耐药可能具有良好的治疗效果。另外,APN 在肿瘤转移方面也发挥着重要作用[4],因此该蛋白是一个很好的抗肿瘤治疗靶点[5]。

目前已有多个实验室从事小分子氨肽酶N 抑制剂的合成[6-8],因此检测目标化合物对氨肽酶N 的抑酶活性是必不可少的步骤。而原有的氨肽酶N 抑制剂抑酶活性检测试剂盒的酶源是从猪肾小体中提取的氨肽酶,已有文献表明,使用该试剂盒测定化合物抑酶活性不能准确反映对人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。同时该试剂盒价格昂贵(Sigma,L6007),使用成本较高。因此本课题组开发了一种全新的方法,以人源的氨肽酶N 作为酶源,用于测定化合物的抑酶活性。我们从多种肿瘤细胞匀浆筛选到人白血病K562 细胞匀浆对APN 底物的催化能力最弱,使用该细胞以慢病毒过表达APN,并筛选到单克隆细胞株(K562-APN),以该细胞匀浆作为酶源用于化合物抑酶活性评价[10]。本文主要对该试剂盒的精密度、准确度、稳定性等进行检测,评价该试剂盒能否用于氨肽酶N 抑制剂的抑酶活性测定。

1 仪器与试药

多功能读板机SpectraMax M5(Molecular Devices),超声细胞破碎仪(南京宁凯仪器有限公司),DNP-9082 电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司),HH-2 数显电子恒温水浴锅(常州国华电器有限公司),离心机(Eppendorf)。L-亮氨酰对硝基苯胺(Sigma,L9125),K562 细胞株(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库),乌苯美司(Sigma),Hyclone 1640 液体培养基(美国Hyclone 公司),Excell 新生牛血清(上海依科赛生物制品有限公司)。

2 方法

2.1 精密度测定

以人白血病K562-APN 细胞匀浆为酶源,L-亮氨酰对硝基苯胺为底物,测定乌苯美司对氨肽酶N 抑制作用的IC50。重复测定3 次,用变异系数来评价。向96 孔板中分别加入90 μL 氨肽酶N 溶液和不同浓度梯度的乌苯美司溶液(25、50、100、200、400 μmol·L-1),37℃孵育5 min 后,加入10 μL 底物溶液。设置100%组(只加酶和底物),用磷酸盐缓冲液补足体积至140 μL。37℃孵育1 h,用多功能读板机测定405 nm 处的吸光度值,通过酶活力变化评价乌苯美司对氨肽酶N 的抑制作用,计算半数抑制浓度IC50。重复测定3次,取平均值和标准偏差,计算变异系数。

抑制率=(OD100%组-OD抑制剂组)/OD100%组×100%

2.2 准确度测定

在96 孔板中加入10 μL 底物,再分别加入0、20、40、60、80、100 μL 氨肽酶N,测量读取吸光度。以氨肽酶N 加入量为横坐标,吸光度为纵坐标,通过线性方程计算出氨肽酶N 加入量为10、30、50、70、90 μL 时的理论值。再另外加入10 μL 底物,分别加入10、30、50、70、90 μL氨肽酶N,孵育后,读取吸光度,重复测定3 次,取平均值,测得的吸光度为实际值,计算准确度。

2.3 稳定性测定

取四管氨肽酶N,置于-20℃冰箱,分别反复冻融0、10、20、30 次,冻融后加入底物,37℃孵育后测定吸光度,重复进行3 次,取平均值,用U=[△A/(0.01t)]×D计算酶活力。

U为酶活力;△A为反应时间内吸光度值的变化;t为反应时间(min);D为稀释倍数,即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。

2.4 线性范围测定

在96 孔板中加入10 μL 底物,再分别加入0、20、40、60、80、100、120 μL 氨肽酶N,用磷酸盐缓冲液补足体积至120 μL,加入底物37℃孵育后,测定405 nm 处的吸光度,重复测定3次,取平均值。

2.5 Km 值测定

将10 μL 不同浓度的底物和10 μL 氨肽酶N 加入96 孔板,使底物的工作浓度分别为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol·L-1,37℃恒温孵育5 min。设置实验组和对照组,对照组不含氨肽酶N,用磷酸盐缓冲液补足体积至100 μL,设置多功能读板机孵育温度为37 ℃,每分钟测一次吸光度,共测15 min,即15 组数据。根据Lineweaver-Burk 公式计算:

1/V=Km/Vm·1/[S]+1/Vm

1/V为酶促反应速度的倒数;Km为米氏常数;1/[S]为底物浓度的倒数;Vm为最大反应速度。

3 结果

3.1 精密度

重复测定3 次乌苯美司对APN 酶活的抑制率,测得IC50的均值为77.41,标准偏差为3.32。变异系数CV为4.29%(<15%),说明3 组数据间变化小,试剂盒的重现性良好。

3.2 准确度

以测得的实际吸光度与理论吸光度做差。残差分别为△A1=0.0102, △A2=0.0037,△A3=0.0122,△A4=0.011,△A5=0.0023。残差均值△A=0.0079,残差标准偏差为0.0045,标准化残差δ*=残差的均值/残差的标准差=1.747,δ*遵从标准正态分布N(0,1)。实验点的标准化残差落在(-2,2)区间以内,可在95%置信度将其判为正常实验点,参与回归直线拟合。以上数据表明,该试剂盒的准确度好,能保证后续实验数据的准确可靠性。

3.3 稳定性

对试剂盒所用酶源的稳定性进行评价,取四管氨肽酶N 于-20℃冰箱,分别反复冻融0、10、20、30 次后测定酶活性,重复测定3 次。在反复冻融5 次后酶活力开始有所下降,反复冻融30 次后酶活力下降了28.1%,且在冻融20 ~30次后酶活力趋于稳定,说明酶源的稳定性良好。结果见图1。

图1 氨肽酶N 反复冻融对酶活力的影响Fig 1 Effect of repeated freezing and thawing on the enzyme activity of aminopeptidase N

3.4 线性范围

以“2.4”项下测得的吸光度作图,线性拟合后所得回归方程Y=0.0026X+0.0285,R2=0.9827。结果表明氨肽酶N 加入量在0 ~120 μL表现出良好的线性相关,见图2。

图2 酶法测定氨肽酶N 的线性范围Fig 2 Enzymatic determination of the linearity of aminopeptidase N

3.5 米氏常数Km

Km是酶促反应最大速度一半时底物的浓度,Km越小说明酶与底物的亲和力越大。为了进一步确认该试剂盒提供的酶源与底物的亲和力,本研究采用Lineweaver-Burk 双倒数法测定该酶的Km值。通过检测405 nm 处不同底物浓度孔每分钟的吸光度值,计算每个浓度的反应速率,见图3。以底物浓度的倒数1/[S]作为横坐标,反应速率的倒数1/V为纵坐标作图,线性拟合所得直线与横坐标1/[S]交点为-1/Km,见图4。商品化试剂盒的Km为0.295 mmol·L-1,而该试剂盒的Km值为0.121 mmol·L-1,表明该试剂盒提供的酶与底物的亲和力更大。

图3 不同浓度底物的反应速率Fig 3 Reaction rate of different concentrations of substrate

图4 氨肽酶N 对L-Leu-P-nitroanilide 的动力学常数Fig 4 Kinetic constants of aminopeptidase N on L-Leu-P-nitroanilide

4 讨论

由于当前商品化的氨肽酶N 抑酶活性测定试剂盒价格昂贵,且所用酶源是从猪肾小体中提取,因此所测数据不能准确反应化合物对人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。

本文对课题组开发的试剂盒的各项参数进行了测定,实验结果表明变异系数CV=4.29%符合CV<15%的要求,说明该试剂盒具有良好的精确度,能保证后续开展实验的合理可靠性[11]。在准确度实验中,标准化残差δ*=1.747,δ*遵从标准正态分布N(0,1),落在(-2,2)区间以内,在95%置信度内是正常试验点,说明数据准确可靠[12-13]。酶作为一种生物催化剂,能够以较少的量进行快速有效的反应,同时其反应有最适温度及pH,因此酶的保藏温度都是低温保藏。而在长时间的使用过程中常会进行反复冻融,加之沉降作用,会导致后续酶促效率的降低,本研究结果表明,氨肽酶N 于-20℃冰箱和室温反复冻融5 次后酶活力开始下降,冻融20 ~30 次后酶活力趋于稳定,酶活力反复冻融30 次后下降28.1%,稳定性良好。验证试剂盒的生物参考区间的结果表明,当底物为10 μL,氨肽酶N ≤120 μL 时测定的结果是可靠的。Km结果表明该试剂盒提供的酶与底物的亲和力更大,能更准确反映化合物对人源氨肽酶N 的抑酶活性。

以上评价数据表明本课题组开发的试剂盒,能准确测定化合物对人源氨肽酶N 的抑酶活性。同时K562 细胞为悬浮培养细胞,适合大规模培养,能够大量得到酶源,成本低廉。本试剂盒的抑酶活性评价方法,已开始在小范围应用,数据可靠,反馈良好,具备推广应用及开发价值。

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