一种氨肽酶N抑制剂抑酶活性检测试剂盒的开发

周奕婷，徐鑫悦，宋吉亮，李玉天，葛彬彬，王森森，房春燕，王学健（潍坊医学院药学院，山东潍坊 261053）

氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是半静息态肝癌干细胞的生物标志物[1]，增强APN 表达能促进肝癌干细胞存活。普通肝癌细胞单用化疗药氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）处理，APN上调，随之产生耐药性，合用APN 抑制剂乌苯美司（ubenimex）能明显增强5-FU、顺铂、阿霉素的细胞毒作用，减少肝癌肿瘤干细胞球形成[2-3]，提示靶向抑制APN 对于肝癌耐药可能具有良好的治疗效果。另外，APN 在肿瘤转移方面也发挥着重要作用[4]，因此该蛋白是一个很好的抗肿瘤治疗靶点[5]。

目前已有多个实验室从事小分子氨肽酶N 抑制剂的合成[6-8]，因此检测目标化合物对氨肽酶N 的抑酶活性是必不可少的步骤。而原有的氨肽酶N 抑制剂抑酶活性检测试剂盒的酶源是从猪肾小体中提取的氨肽酶，已有文献表明，使用该试剂盒测定化合物抑酶活性不能准确反映对人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。同时该试剂盒价格昂贵（Sigma，L6007），使用成本较高。因此本课题组开发了一种全新的方法，以人源的氨肽酶N 作为酶源，用于测定化合物的抑酶活性。我们从多种肿瘤细胞匀浆筛选到人白血病K562 细胞匀浆对APN 底物的催化能力最弱，使用该细胞以慢病毒过表达APN，并筛选到单克隆细胞株（K562-APN），以该细胞匀浆作为酶源用于化合物抑酶活性评价[10]。本文主要对该试剂盒的精密度、准确度、稳定性等进行检测，评价该试剂盒能否用于氨肽酶N 抑制剂的抑酶活性测定。

1 仪器与试药

多功能读板机SpectraMax M5（Molecular Devices），超声细胞破碎仪（南京宁凯仪器有限公司），DNP-9082 电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），HH-2 数显电子恒温水浴锅（常州国华电器有限公司），离心机（Eppendorf）。L-亮氨酰对硝基苯胺（Sigma，L9125），K562 细胞株（中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），乌苯美司（Sigma），Hyclone 1640 液体培养基（美国Hyclone 公司），Excell 新生牛血清（上海依科赛生物制品有限公司）。

2 方法

2.1 精密度测定

以人白血病K562-APN 细胞匀浆为酶源，L-亮氨酰对硝基苯胺为底物，测定乌苯美司对氨肽酶N 抑制作用的IC50。重复测定3 次，用变异系数来评价。向96 孔板中分别加入90 μL 氨肽酶N 溶液和不同浓度梯度的乌苯美司溶液（25、50、100、200、400 μmol·L－1），37℃孵育5 min 后，加入10 μL 底物溶液。设置100%组（只加酶和底物），用磷酸盐缓冲液补足体积至140 μL。37℃孵育1 h，用多功能读板机测定405 nm 处的吸光度值，通过酶活力变化评价乌苯美司对氨肽酶N 的抑制作用，计算半数抑制浓度IC50。重复测定3次，取平均值和标准偏差，计算变异系数。

抑制率＝（OD100%组－OD抑制剂组）/OD100%组×100%

2.2 准确度测定

在96 孔板中加入10 μL 底物，再分别加入0、20、40、60、80、100 μL 氨肽酶N，测量读取吸光度。以氨肽酶N 加入量为横坐标，吸光度为纵坐标，通过线性方程计算出氨肽酶N 加入量为10、30、50、70、90 μL 时的理论值。再另外加入10 μL 底物，分别加入10、30、50、70、90 μL氨肽酶N，孵育后，读取吸光度，重复测定3 次，取平均值，测得的吸光度为实际值，计算准确度。

2.3 稳定性测定

取四管氨肽酶N，置于－20℃冰箱，分别反复冻融0、10、20、30 次，冻融后加入底物，37℃孵育后测定吸光度，重复进行3 次，取平均值，用U＝[△A/（0.01t）]×D计算酶活力。

U为酶活力；△A为反应时间内吸光度值的变化；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。

2.4 线性范围测定

在96 孔板中加入10 μL 底物，再分别加入0、20、40、60、80、100、120 μL 氨肽酶N，用磷酸盐缓冲液补足体积至120 μL，加入底物37℃孵育后，测定405 nm 处的吸光度，重复测定3次，取平均值。

2.5 Km 值测定

将10 μL 不同浓度的底物和10 μL 氨肽酶N 加入96 孔板，使底物的工作浓度分别为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mmol·L－1，37℃恒温孵育5 min。设置实验组和对照组，对照组不含氨肽酶N，用磷酸盐缓冲液补足体积至100 μL，设置多功能读板机孵育温度为37 ℃，每分钟测一次吸光度，共测15 min，即15 组数据。根据Lineweaver-Burk 公式计算：

1/V＝Km/Vm·1/[S]＋1/Vm

1/V为酶促反应速度的倒数；Km为米氏常数；1/[S]为底物浓度的倒数；Vm为最大反应速度。

3 结果

3.1 精密度

重复测定3 次乌苯美司对APN 酶活的抑制率，测得IC50的均值为77.41，标准偏差为3.32。变异系数CV为4.29%（＜15%），说明3 组数据间变化小，试剂盒的重现性良好。

3.2 准确度

以测得的实际吸光度与理论吸光度做差。残差分别为△A1＝0.0102， △A2＝0.0037，△A3＝0.0122，△A4＝0.011，△A5＝0.0023。残差均值△A＝0.0079，残差标准偏差为0.0045，标准化残差δ*＝残差的均值/残差的标准差＝1.747，δ*遵从标准正态分布N（0，1）。实验点的标准化残差落在（－2，2）区间以内，可在95%置信度将其判为正常实验点，参与回归直线拟合。以上数据表明，该试剂盒的准确度好，能保证后续实验数据的准确可靠性。

3.3 稳定性

对试剂盒所用酶源的稳定性进行评价，取四管氨肽酶N 于－20℃冰箱，分别反复冻融0、10、20、30 次后测定酶活性，重复测定3 次。在反复冻融5 次后酶活力开始有所下降，反复冻融30 次后酶活力下降了28.1%，且在冻融20 ～30次后酶活力趋于稳定，说明酶源的稳定性良好。结果见图1。

图1 氨肽酶N 反复冻融对酶活力的影响Fig 1 Effect of repeated freezing and thawing on the enzyme activity of aminopeptidase N

3.4 线性范围

以“2.4”项下测得的吸光度作图，线性拟合后所得回归方程Y＝0.0026X＋0.0285，R2＝0.9827。结果表明氨肽酶N 加入量在0 ～120 μL表现出良好的线性相关，见图2。

图2 酶法测定氨肽酶N 的线性范围Fig 2 Enzymatic determination of the linearity of aminopeptidase N

3.5 米氏常数Km

Km是酶促反应最大速度一半时底物的浓度，Km越小说明酶与底物的亲和力越大。为了进一步确认该试剂盒提供的酶源与底物的亲和力，本研究采用Lineweaver-Burk 双倒数法测定该酶的Km值。通过检测405 nm 处不同底物浓度孔每分钟的吸光度值，计算每个浓度的反应速率，见图3。以底物浓度的倒数1/[S]作为横坐标，反应速率的倒数1/V为纵坐标作图，线性拟合所得直线与横坐标1/[S]交点为－1/Km，见图4。商品化试剂盒的Km为0.295 mmol·L－1，而该试剂盒的Km值为0.121 mmol·L－1，表明该试剂盒提供的酶与底物的亲和力更大。

图3 不同浓度底物的反应速率Fig 3 Reaction rate of different concentrations of substrate

图4 氨肽酶N 对L-Leu-P-nitroanilide 的动力学常数Fig 4 Kinetic constants of aminopeptidase N on L-Leu-P-nitroanilide

4 讨论

由于当前商品化的氨肽酶N 抑酶活性测定试剂盒价格昂贵，且所用酶源是从猪肾小体中提取，因此所测数据不能准确反应化合物对人源氨肽酶N 的抑制作用[9]。

本文对课题组开发的试剂盒的各项参数进行了测定，实验结果表明变异系数CV＝4.29%符合CV＜15%的要求，说明该试剂盒具有良好的精确度，能保证后续开展实验的合理可靠性[11]。在准确度实验中，标准化残差δ*＝1.747，δ*遵从标准正态分布N（0，1），落在（－2，2）区间以内，在95%置信度内是正常试验点，说明数据准确可靠[12-13]。酶作为一种生物催化剂，能够以较少的量进行快速有效的反应，同时其反应有最适温度及pH，因此酶的保藏温度都是低温保藏。而在长时间的使用过程中常会进行反复冻融，加之沉降作用，会导致后续酶促效率的降低，本研究结果表明，氨肽酶N 于－20℃冰箱和室温反复冻融5 次后酶活力开始下降，冻融20 ～30 次后酶活力趋于稳定，酶活力反复冻融30 次后下降28.1%，稳定性良好。验证试剂盒的生物参考区间的结果表明，当底物为10 μL，氨肽酶N ≤120 μL 时测定的结果是可靠的。Km结果表明该试剂盒提供的酶与底物的亲和力更大，能更准确反映化合物对人源氨肽酶N 的抑酶活性。

以上评价数据表明本课题组开发的试剂盒，能准确测定化合物对人源氨肽酶N 的抑酶活性。同时K562 细胞为悬浮培养细胞，适合大规模培养，能够大量得到酶源，成本低廉。本试剂盒的抑酶活性评价方法，已开始在小范围应用，数据可靠，反馈良好，具备推广应用及开发价值。