六味地黄提取物及其联合顺铂对人肝癌BEL-7402细胞迁移和血管新生因子基因表达的影响

周牡娜，刘检，石雕，刘蓉，邹自征，欧阳方丹*（.益阳医学高等专科学校，湖南 益阳 4000；.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 40000；.湖南省直中医医院，湖南 株洲 4000）

由于恶性肿瘤性质类型各异、累及的组织和器官不同、病期不同以及现在诊断技术的局限，大多数恶性肿瘤患者在确诊时已为中晚期，手术治疗无法实现，因而治疗药物的研发十分必要[1]。目前中医药治疗肿瘤的临床研究正进入循证医学、个体化、规范化的时代，因其有降低毒副作用、减轻症状或延长带瘤生存期等特点得到了广泛认可[2]。顺铂是临床治疗中常用的化疗药物，但顺铂产生的肾毒性、耳毒性、耐药性等在临床上不可避免，近年来以顺铂为核心联合用药的“增效减毒”研究较多[3]，而六味地黄具有改善肾功能、抗氧化、改善免疫功能、消除自由基、抗肿瘤等作用[4]。研究发现六味地黄丸能够对放疗具有增效减毒的作用[5]，同时通过减少诱发肿瘤炎症因子的生成，调节免疫力，增强抗癌基因和抑制原癌基因表达等来发挥抗肿瘤作用[6]。本文通过观察六味地黄提取物及其联合顺铂对人肝癌BEL-7402 一般形态学和细胞迁移的影响，并探讨其对血管新生因子基因表达水平的影响，阐述其抗肿瘤的可能机制，为临床治疗肝癌提供参考依据。

1 材料

1.1 六味地黄药材

六味地黄由熟地黄（玄参科植物地黄干燥块根，益阳三和中药饮片有限公司）24 g，山萸肉（山茱萸科植物山茱萸果肉，三湘中药饮片有限公司）12 g，山药（薯蓣科植物薯蓣干燥根茎，永靛中药饮片有限公司）12 g 及泽泻（泽泻科植物泽泻的干燥块茎，三湘中药饮片有限公司）、牡丹皮（毛茛科植物牡丹干燥根皮，三湘中药饮片有限公司）、茯苓（多孔菌科真菌茯苓干燥菌核，博世康中医药有限公司）各9 g 组成，经湖南省直中医医院药学部主管药师石雕鉴定以上中药饮片均符合用药标准。

1.2 仪器及试药

CO2培养箱（美国Thermo 公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、1640 培养基（Gibco 公司）；血管内皮生长因子（VEGF）、血管素-2（Ang-2）、血小板反应素（TSP）、金属蛋白酶-2 组织抑制因子（TIMP2）人抗体（武汉博士德公司）；顺铂（齐鲁制药有限公司，规格：10 mg，批号：8C0214B02）。

1.3 细胞株

人肝癌BEL-7402 细胞（Procell）。

2 方法

2.1 六味地黄提取物的制备

按“1.1”项下药材量打粉过筛后称取粉末25 g，用60%乙醇50 mL 浸润6 h，超声（25 Hz，60 ℃）提取40 min，过滤，滤渣用60%乙醇50 mL 提取40 min，过滤，合并滤液，挥干乙醇，定容至25 mL，制备成生药含量为1 g·mL－1的提取物待用。作用于细胞前，先用培养基稀释至500 mg·mL－1，再用0.22 μm 微孔滤膜过滤，灭菌，并用培养基稀释至所需的药物浓度。

2.2 初筛六味地黄提取物给药浓度

调整BEL-7402 细胞密度至5000 个/孔接种于96 孔培养板，静置培养24 h，设置六味地黄提取物质量浓度梯度（500、400、300、200、100、50、25、12.5 mg·mL－1，即C1 ～C8），另设对照组，合计9 组，每组3 个复孔。待细胞充分贴壁后，加入不同质量浓度六味地黄提取物，正常组则加入等体积的培养液。分别继续培养48 h、72 h 后，每孔加入完全培养基180 μL、CCK8 溶液20 μL，孵育4 h 后用酶标仪于450 nm 波长下测定各孔吸光度值（A），并计算各组细胞的相对抑制率。

2.3 观察BEL-7402 细胞的一般形态学

胰蛋白酶溶液消化BEL-7402 细胞后接种于6孔细胞培养板中，每组设置3 个复孔。培养至细胞完全贴壁后，顺铂（1 mg·mL－1）组、六味地黄提取物（100 mg·mL－1）组、联合用药（六味地黄提取物100 mg·mL－1＋顺铂1 mg·mL－1）组加入相应药物，对照组加入等量培养液。分别处理48 h 后，倒置显微镜下观察细胞生长状态及形态学。

2.4 细胞划痕法检测BEL-7402 细胞迁移能力

将对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，调整至适宜密度，接种于6 孔细胞培养板，每组设置3 个复孔。培养至细胞完全贴壁后，弃掉孔内液体，换成无血清基础培养基过夜，次日采用200 μL 规格的枪头，同时用直尺比着均匀划出“十”字，PBS 润洗3 次，加入低血清（含5%FBS）培养基，除对照组给予等量培养液外，其余各组加入相应药物，继续培养48 h 后，对各孔“十”字的四个边进行观察，并拍照记录细胞生长及迁移情况，随机选取10 个视野进行计数，并计算细胞迁移率。

2.5 Western blot 法检测VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2 蛋白表达

按“2.3”项下方法培养后收集细胞，加入RIPA 细胞裂解液和含1%PMSF 蛋白酶抑制剂混合液，于4℃条件下裂解2 h，12 000 r·min－1离心15 min，吸取上清液，分装备用。采用BCA 法进行蛋白（TSP、TIMP2、VEGF、Ang-2）含量测定，依据蛋白分子质量大小选择适宜的电泳浓缩胶和分离胶。待上样缓冲液和蛋白样品混匀、变性后，进行上样、电泳、转模、封闭后，加入一抗稀释液（VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2），孵育过夜（4℃），加入二抗缓冲液（HRP 标记），室温振摇孵育1 h，通过定量分析和蛋白印迹成像系统进行扫描，计算各蛋白目标蛋白条带与内参蛋白条带的光密度比值以表示目标蛋白的相对表达量。

2.6 RT-PCR 法检测VEGF、Ang-2、TSP、TIMP2基因水平

将细胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化后，调整至适宜密度，接种于6 孔细胞培养板，每组设置3 个复孔。培养至细胞完全贴壁后，各干预组加入对应的药物，对照组加入等量培养液。37℃、5%CO2培养箱培养48 h，吸弃培养基，PBS 润洗2 次，采用Trizol 法（4℃，60 min）提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒转录合成cDNA，以real-time PCR 仪进行扩增，用2－△△Ct法检测目标基因mRNA 的相对表达量。

2.7 统计学处理方法

实验数据用±s表示，SPSS 20.0 软件统计分析，组间比较采用单因素方差分析，并用LSD-t检验进行两两比较，P＜0.05 代表差异有统计学意义。

3 结果

3.1 六味地黄提取物给药浓度初筛结果

不同质量浓度六味地黄提取物对BEL-7402细胞均具有明显的抑制作用，质量浓度为100 mg·mL－1作用48 h 后的平均细胞抑制率更接近50%，结果见图1，故选择质量浓度为100 mg·mL－1作用时间48 h 进行后续实验。

图1 不同浓度六味地黄提取物对BEL-7402 细胞的影响Fig 1 Effect of different concentrations of Liuwei Dihuang extracts on BEL-7402 cells

3.2 对BEL-7402 细胞一般形态学的影响

对照组细胞生长状态良好，细胞分布均匀，胞质均匀透亮，胞核清晰。与对照组比较，六味地黄提取物组、顺铂组、联合用药组细胞干预48 h 后均可见贴壁细胞减少，部分细胞变圆变小，细胞间距增大，脱落浮于培养液中；联合用药组可见有较多待脱落细胞。结果见图2。

3.3 对BEL-7402 细胞迁移能力的影响

与对照组比较，细胞划痕面积愈合率顺铂组为（35.6±3.5）%、六味地黄提取物组为（42.6±2.8）%、联合用药组为（28.4±4.2）%，细胞迁移能力均下降，两侧细胞间距明显加大，无细胞向划痕处迁移生长，且死亡细胞显著增加。结果见图3。

图3 各组对BEL-7402 细胞迁移的影响（100×）Fig 3 Effect of each group on the migration of BEL-7402 cells（100×）

3.4 对细胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 蛋白表达水平的影响

与对照组比较，六味地黄提取物组、顺铂组、联合用药组BEL-7402 细胞内TSP、TIMP2 蛋白表达水平显著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表达水平显著降低；与六味地黄提取组和顺铂组比较，联合用药组细胞内TSP、TIMP2 蛋白表达水平显著升高，VEGF、Ang-2 蛋白表达水平显著降低。结果见图4。

图4 各组细胞内VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 蛋白表达水平（± s，n ＝3）Fig 4 Protein expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

3.5 对细胞TSP、TIMP2、VEGF 及Ang-2 基因表达水平的影响

与对照组比较，六味地黄提取物组、顺铂组、联合用药组细胞内TSP、TIMP2 mRNA 表达水平显著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表达水平显著降低；与六味地黄提取组和顺铂组比较，联合组细胞内TSP、TIMP2 mRNA 表达水平显著升高，VEGF、Ang-2 mRNA 表达水平显著降低，结果见图5。

图5 各组细胞内VEGF、Ang-2、TSP 及TIMP2 基因表达情况（± s，n ＝3）Fig 5 Gene expression of VEGF，Ang-2，TSP，and TIMP2 in each group（± s，n ＝3）

4 讨论

目前，每年全球新增肝癌患者30 万～100万例[7]，中国占全世界发病人数的50% 以上[8]。血管新生是指从已经存在的毛细血管网上再大量生成新生血管的过程，新生血管为无限增殖的细胞提供充足的养料和氧气[9]。当肿瘤生长到1 ～2 mm 时，肿瘤内部就会有新生血管的生成，以维持肿瘤细胞对氧气和营养物质的需要，新生血管已成为一个具有肿瘤治疗前景的靶点[10]。新生血管功能和结构的不完整可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和远处转移[11]。新生血管是肿瘤生长、转移的基础。肿瘤细胞的无限增殖和迁移是肝癌相关死亡的重要原因。细胞划痕实验结果显示，与对照组比较，各用药组BEL-7402 细胞间距明显加大，无细胞向划痕处迁移生长，且死亡细胞显著增加，其中联合用药组的抑制细胞迁移作用更为明显，提示六味地黄提取物及其联合顺铂对BEL-7402 细胞迁移生长具有明显的抑制作用。

肿瘤新生血管形成过程与促血管生成因子和抗血管生成因子正负调节失衡有关，血管系统被激活，导致血管生长过度或退化，新生血管是肿瘤发生和发展中一个重要的病理特征。VEGF 是一种同源二聚体糖蛋白，是调控血管生成的重要表达因子，VEGF 表达上调可促进血管内皮细胞有丝分裂、新生血管生成。此外，VEGF 还可以自分泌的形式促进肿瘤细胞生长[12]。肿瘤组织的缺氧、缺血、ras基因突变等生物因子的变化也会影响VEGF 的表达等[13]。Ang-2 主要呈点状分布，仅局限在内皮细胞和相关的外周细胞中，通过抑制 Ang-1 活化程度，形成内分泌调节环路以维持血管生长、退化的动态平衡。Ang-2 的表达增加可促进肿瘤血管新生和新的毛细血管再建及形成[14]。有研究表明，Ang-2 在肿瘤组织中呈高表达[15]。本实验结果显示，与对照组比较，各干预组细胞内VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA 表达水平显著降低；与六味地黄提取组和顺铂组比较，联合用药组细胞内VEGF、Ang-2 蛋白和mRNA表达水平显著降低。这提示六味地黄提取物及其联合顺铂可能通过抑制VEGF、Ang-2 mRNA 表达，继而下调VEGF、Ang-2 蛋白表达水平来抑制血管新生。血小板反应蛋白（TSP）能够抑制内皮细胞的增殖及迁移、抑制内皮细胞管状结构形成，是一种有效的抗血管新生活性的分泌蛋白。研究发现，TSP 可通过影响抑制基质金属蛋白酶的转化成有活性的形式以及通过结合CD36和CD148受体，抑制肝癌细胞迁移和新生血管生成[16]。基质金属蛋白酶（MMPs）是目前发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，以无活性的酶原形式分泌，在细胞外基质重塑的部位易于诱导表达。TIMP 是MMPs 的内源性特异性抑制因子[17]。MMP2 是明胶酶，能特异性的降解基膜中的Ⅳ型胶原，促进肿瘤的转移，TIMP2 是MMP2 的抑制剂，属于非糖基化蛋白，它以共价键的形式与MMP2 相结合成1∶1 复合体，对血管新生具有重要的调节作用，被证实可抑制多种癌症的恶性转移过程[18]。本研究结果显示，与对照组比较，各用药组中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表达水平均显著升高；与顺铂组和六味地黄提取物组比较，联合用药组中TSP、TIMP2 的蛋白和mRNA 表达水平均显著升高。这提示六味地黄提取物及其联合顺铂可能通过促进TSP、TIMP2 mRNA 表达，继而上调TSP、TIMP2 蛋白表达水平发挥抑制抗血管新生的作用。

综上，六味地黄提取物及其联合顺铂对BEL-7402 细胞迁移生长具有明显的抑制作用，并可能通过促进BEL-7402 细胞TSP、TIMP2 的mRNA表达水平，抑制VEGF、Ang-2 的mRNA 表达水平来抑制肝癌细胞血管新生。本研究从基因表达水平研究六味地黄提取物抗肿瘤的机制，为其临床抗肿瘤提供了参考依据，后续将进一步通过体内动物实验探究六味地黄提取物联合顺铂抗肿瘤的作用机制。