高产乙酸乙酯酵母菌的筛选及其在清香型小曲白酒生产中的应用

许 银，杨 强，张 龙，陈佳兴，刘源才，陈 凯，程学勋，陈申习*

（1.劲牌有限公司 劲牌研究院 中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000；2.宜宾六尺巷酒业有限公司，四川 宜宾 644000）

酯类物质作为一种具有芳香性气味的易挥发性化合物，大多具有水果香味，广泛存在于各类香型白酒中，对于协调白酒的香气和提升口感具有重要的作用[1-3]。在众多酯类物质中，以乙酸乙酯研究较多，特别是在清香型白酒研究领域[4-7]。现有研究表明，乙酸乙酯是清香型白酒的主体呈香物质，对清香型白酒风格的形成具有重要作用，决定着清香型白酒的质量分级[8-9]。

清香型白酒中乙酸乙酯的产生，是生香酵母以及酶催化作用形成的[10-11]。产酯能力较强的酵母包括毕赤酵母属（Pichia）、汉逊酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）等[12-14]。目前，作为清香型白酒的重要分支，清香型小曲白酒中乙酸乙酯含量相对较低。原因在于白酒发酵过程中氧气的快速消耗，与产酯有关的大多数酵母代谢能力大幅减弱。同时，由于环境因子的胁迫，产酯酵母数量急剧下降，从而导致小曲白酒中乙酸乙酯含量不足。近年来，许多白酒企业尝试延长发酵周期或者在蒸馏时添加乙酸乙酯，来提高成品酒中乙酸乙酯含量，这虽取得了一定效果，但在实际运用中受到很多限制。白酒发酵中的微生物可产生乙酸乙酯，所以要从根本上提升乙酸乙酯含量，还需从菌株自身发酵性能方面开展工作[15-18]。

本研究从浓香型大曲中分离纯化酵母菌，结合形态学观察和分子生物学鉴定，经过高粱汁发酵初筛、固态发酵复筛，以获得高产乙酸乙酯的酵母菌，并将其应用于清香型小曲白酒工业生产。这对于提升发酵后原酒中乙酸乙酯含量，提高清香型小曲白酒的口感和品质，满足消费者对高品质白酒的需求具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

浓香型大曲：四川宜宾六尺巷酒业有限公司；东北粳高粱：黑龙江大庆；麸皮：河南飞天农业开发股份有限公司。

1.1.2 化学试剂

β-淀粉酶（酶活50 000 U/g）、糖化酶（酶活100 000 U/g）：无锡雪梅酶制剂科技有限公司；真菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：上海生工生物技术服务公司；DNA凝胶回收试剂盒：美国AXYGEN公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯等标准品（均为色谱纯）：中国医药集团有限公司；硫酸（分析纯）：中国医药集团有限公司。Q5高保真DNA聚合酶：美国NEB公司；聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）混合液、引物ITS1和ITS4：宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.1.3 培养基

华伦斯坦实验室（Wallestein laboratory，WL）营养琼脂培养基[19]：葡萄糖50 g/L，酵母浸粉4 g/L，蛋白胨5 g/L，硫酸镁0.125 g/L，磷酸二氢钾0.55 g/L，氯化钾0.425 g/L，氯化钙0.125g/L，硫酸锰0.002 5 g/L，氯化铁0.002 5 g/L，溴甲酚绿0.022g/L（灭菌后添加），琼脂20 g/L，青霉素0.1 g/L，调节pH为6.5，121 ℃灭菌20 min。酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基[19]：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，青霉素0.1 g/L。固体培养基添加琼脂粉20 g/L。121 ℃灭菌30 min。

高粱汁培养基[19]：高粱200 g经粉碎后，加蒸馏水800 mL，然后添加β-淀粉酶10 g和糖化酶10 g，置于60 ℃恒温箱中糖化24 h，经过滤得滤液，滤液糖度调整为10°Bx。

高粱固体培养基：取1 kg粳高粱放置不锈钢容器中，添加温度为60 ℃的蒸馏水没过高粱表面，培养箱控制温度为60 ℃，浸泡18 h，然后沥干泡粮水，用抹布包裹高粱进行初蒸（121 ℃、30 min）、焖粮（80 ℃、40 min）、复蒸（115 ℃、15 min），即为高粱固体培养基。

麸皮培养基：取一定质量麸皮，添加蒸馏水，使得含水量在45%～50%之间，于121 ℃灭菌45 min。

1.2 仪器与设备

AL204电子分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；JJ1000电子天平：常熟双杰测试仪器厂；SFG-02B电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备仪器厂；QYC-200全温空气摇床：上海福玛实验设备有限公司；YXQ-LS-75S蒸汽灭菌锅、SPX-100B-Z生化培养箱：上海博讯实业有限公司；5424R艾本德小型离心机：艾本德（中国）仪器有限公司；YPZQ-45圆盘制曲机：烟台良荣机械精业有限公司；BCM-1600A洁净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；Nikon ECLIPSE E200显微镜：日本Nikon公司；Agilent 7890A型气相色谱（gas chromatography，GC）仪（配有氢火焰检测器和7863型自动进样器）：美国安捷伦公司；2720型PCR仪：美国ABI公司；DYY-6C型电泳仪：北京六一仪器厂；BG-gdsAUTO（130）凝胶成像系统：北京百晶生物科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酵母菌的分离纯化[20]

将浓香型大曲样品用粉碎机粉碎后，制成粉状备用。称取曲粉5 g，放入盛有95 mL无菌水并带有玻璃珠的250 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min条件下振荡培养30 min，制成菌悬液。按10倍梯度系列将菌悬液稀释至10-4，取稀释度为10-1、10-2、10-3和10-4的曲粉溶液0.2 mL分别涂布于WL营养琼脂培养基中，于30 ℃条件下培养24～48 h后，挑取单菌落划线于YPD培养基上，30 ℃条件下培养48 h。经过2～3次平板划线后得到初步纯化的菌落，4 ℃保存，备用。

1.3.2 酵母菌的鉴定

（1）形态观察

参考《真菌鉴定手册》对菌落的颜色、透明度、大小等特征及细胞形态进行描述分类[21]。

（2）分子生物学鉴定

采用DNA提取试剂盒提取酵母菌的基因组DNA，以其为模板，采用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）对其ITS区基因序列进行PCR扩增。PCR扩增体系（25 μL）：PCR缓冲液10 μL，dNTP混合液（2.5 mmol/L）2 μL，引物ITS1（10 μmol/L）1 μL，引物ITS4（10 μmol/L）1 μL，真菌DNA模板2 μL，超纯水8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送华大基因（武汉）测序公司测序。将测序结果提交至美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）的GenBank数据库中，采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性搜索，选取同源性较高的模式菌株的ITS基因序列，采用MEGA 6.0中的邻接（neighbor-joing，NJ）法构建系统发育树。

1.3.3 酵母菌的液态发酵实验

把分离纯化后的单菌落接种于含有10 mL YPD液态培养基的无菌试管中，30 ℃、150 r/min条件下振荡培养48 h，吸取0.4 mL菌液接种于含有50 mL高粱汁培养基的250 mL三角瓶发酵栓中，以不接种任何菌液的高粱汁培养基为空白对照，以市售常用产酯酵母Y0为阳性对照。样品于30 ℃生化培养箱恒温培养，每隔24 h小心振荡发酵栓并称质量，当质量损失＜0.2 g时，停止培养。将培养后的发酵液离心（20 ℃，8 000 r/min）、过滤后，取发酵液，采用气相色谱检测乙酸乙酯及杂醇（异丁醇、异戊醇）含量[22]。

1.3.4 酵母菌麸皮种的制作

酵母菌麸皮种的制作：将筛选得到的酵母菌接种于含有5 mL YPD培养基的试管中，30 ℃、150 r/min振荡培养24 h，然后接入无菌的200 mL YPD液态培养基中，30 ℃、150 r/min培养24 h后作为种子液。按照每g麸皮培养基接种0.5 mL种子液（酵母数量为1×107CFU/mL）进行接种，30 ℃培养36 h，将麸皮培养物35 ℃条件下干燥6～8 h，即得酵母菌麸皮种。

酵母麸皮种的扩大培养：采用圆盘制曲机生产。按照上述比例将酵母种子液接种于麸皮培养基，启动温控系统自动控制圆盘温度在30～32 ℃之间，培养32 h后，出盘干燥，然后粉碎，检测细胞数＞10×108CFU/g为合格。

1.3.5 酵母菌的固态发酵实验

将酵母菌麸皮种，按照质量分数5%添加到劲牌小曲中，以添加市售酵母Y0的劲牌小曲为阳性对照，不添加菌株的劲牌小曲样品为空白对照，在无菌实验室模拟清香型小曲白酒生产工艺条件[23-24]，具体操作工艺流程：泡粮（60 ℃，20 h）、初蒸（121 ℃，30 min）、焖粮（60 ℃，1 h）、复蒸（115 ℃，15 min）、撒曲（1%）、糖化（24 h）、发酵（7 d）。蒸粮结束后，熟粮完全透心，一致性好，水分含量在55%左右；称取糖化醅500 g与配糟（配糟采用车间大生产蒸馏后的鲜糟）按质量比1∶1混匀后入瓶，瓶塞上装2.5 mol/L硫酸密封，在培养箱中30 ℃发酵7 d。发酵结束后，采用固态蒸馏，取100 mL蒸馏液，采用气相色谱检测乙酸乙酯含量[22]。

1.3.6 酵母菌强化酒曲在清香型小曲白酒生产中的应用

采用圆盘制曲机生产出酵母菌麸皮种与车间酒曲进行配比优化，酵母麸皮种按质量比为3∶100添加到酒曲中，制备成车间实验用曲，以不加菌酒曲为空白对照，按清香型小曲白酒车间生产工艺进行中试生产。清香型小曲白酒车间生产工艺：泡粮（75 ℃，17 h）、初蒸（0.12 MPa，30 min）、焖粮（60 ℃，1 h）、复蒸（0.04 MPa，15 min）、加曲（1%）、糖化（22 h）、发酵（14 d）。中试生产每次投粮1 000 kg，发酵结束后经固态蒸馏即得小曲原酒，取100 mL原酒，采用气相色谱检测挥发性风味物质[22]，并进行感官评价。

1.3.7 出酒率的计算

在20 ℃条件下，求得已折算为乙醇体积占比55%的原酒质量，即为原酒产量，计算出单位投粮量的原酒产量即为出酒率[25-26]。

1.3.8 清香型小曲白酒的感官评价

邀请劲牌公司5位国家级白酒评委，参照国家标准GB/T 33404—2016《白酒感官品评导则》对白酒进行感官评价[27]，满分为100分。

1.3.9 数据处理

每个实验重复三次，结果用“平均值±标准差”表示。采用SPSS 19.0分析软件对数据进行标准差及显著性分析，P＜0.05说明差异显著[18]。

2 结果与分析

2.1 酵母菌的分离及形态特征

从浓香型大曲中分离纯化得到2株菌落形态不同的菌株，分别编号为Y87和Y88。其菌落及细胞形态见图1。

图1 菌株Y87（a）与菌株Y88（b）的菌落及细胞形态Fig.1 Colony and cell morphology of strains Y87 (a) and Y88 (b)

由图1可知，菌株Y87的菌落较大，呈白色，表面光滑，无光泽；细胞呈圆形。菌株Y88的菌落较大，呈白色，表面光滑凸起，有光泽；细胞呈圆形或椭圆形。根据《真菌鉴定手册》[21]，初步鉴定这两株菌为酵母菌。

2.2 酵母菌的分子生物学鉴定

基于ITS rDNA基因序列构建菌株Y87及Y88的系统发育树，结果见图2。

图2 基于ITS rDNA基因序列菌株Y87与Y88的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strains Y87 and Y88 based on ITS rDNA gene sequences

由图2可知，菌株Y87与异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）聚于同一分支，亲缘关系最近；菌株Y88与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）聚于同一分支，亲缘关系最近。结合形态学观察，将菌株Y87鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），菌株Y88鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.3 酵母菌的液态发酵实验结果

酵母菌在高粱汁培养基中的发酵性能测定结果见表1。

表1 酵母菌在高粱汁培养基中的发酵性能测定结果Table1 Determination results of fermentation performance of yeasts in sorghum juice medium

由表1可知，酵母菌Y87发酵高粱汁后，CO2质量损失最高，为1.29 g，说明该酵母菌具有一定的产酒能力。从主要挥发性物质乙酸乙酯和杂醇产量来看，酵母菌Y87表现出了较好的产酯能力，乙酸乙酯产量（1.13 g/L）显著高于市售酵母Y0（0.77 g/L）（P＜0.05）且菌株Y87产杂醇量较低（0.056 0 g/L），这对提升原酒品质，协调原酒口感具有促进作用。而菌株Y88产酒和产酯能力较弱。因此，选择菌株Y87进行固态发酵试验。

2.4 酵母菌Y87固态发酵实验结果

将酵母菌Y87添加到酒曲后固态发酵得到的基酒中乙酸乙酯含量见表2。

表2 酵母菌固态发酵得到的基酒中乙酸乙酯含量测定结果Table2 Determination results of ethyl acetate contents in base liquor by yeast solid-state fermentation

由表2可知，菌株Y87固态麸皮种强化到小曲发酵7 d后，菌株Y87酒曲发酵得到的基酒中乙酸乙酯含量达到1.14 g/L，相比空白对照和阳性对照，含量分别提高79.4%和22.8%，表明应用菌株Y87可以显著提高乙酸乙酯的生成量（P＜0.05），可改善原酒的风味。

2.5 菌株Y87强化酒曲在清香型小曲白酒生产中的应用

2.5.1 菌株Y87强化酒曲酿造白酒的挥发性风味物质

菌株Y87强化酒曲酿造白酒中挥发性风味物质测定结果见表3。由表3可知，相比空白对照，菌株Y87强化酒曲酿造白酒出酒率（61.4%）提高了1.2%，乙酸乙酯含量（1.38 g/L）提高36.6%，杂醇含量降低7.1%，正丙醇含量降低16.1%，可显著提升白酒品质（P＜0.05）。

表3 菌株Y87强化酒曲酿造白酒挥发性风味物质测定结果Table3 Determination results of volatile flavor substances in Baijiu brewed by strain Y87 fortified Jiuqu

2.5.2 菌株Y87强化酒曲酿造白酒的感官评价

菌株Y87强化酒曲酿造白酒的感官评分为90.7分，高于空白对照白酒（89.9分），酒品具有清香型小曲白酒的入口醇甜、清香纯正、尾较净等特点，说明通过强化高产乙酸乙酯酵母于酒曲，并应用在清香型小曲白酒生产中，可以提升小曲白酒中风味物质含量。

3 结论

采用WL营养琼脂培养基从浓香型大曲中分离纯化得到2株酵母菌，编号为Y87、Y88，经形态观察及分子生物学技术鉴定其分别为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。经过液态高粱汁培养基、高粱固态发酵培养基发酵筛选得到菌株Y87为高产乙酸乙酯的酵母菌，高粱汁发酵乙酸乙酯产量达到1.13 g/L，高粱固态发酵乙酸乙酯产量达到1.14 g/L。将菌株Y87强化酒曲应用于清香型小曲白酒的酿造，白酒中乙酸乙酯含量提高36.6%，杂醇含量降低7.1%，正丙醇含量降低16.1%，感官评分为90.7分，具有小曲酒的典型特征，入口醇甜，清香纯正。本研究有效地提升了劲牌公司原酒中呈香味物质乙酸乙酯含量，改善了原酒品质，可为发掘纯天然菌株资源提供参考依据。