青蒿琥酯对人Tenon囊成纤维细胞自噬的影响

陈静 罗高权 陈艺

1广州医科大学附属第三医院眼科（广州510150）；2中国人民解放军南部战区总医院（广州510010）

青光眼是一种不可逆的致盲性眼病，其致盲率仅次于白内障［1］，目前医治青光眼最常用的手术方案仍是滤过性手术，但术后滤过通道的瘢痕化是导致手术失败的重要原因。根据报道青光眼滤过性手术最常用的小梁切除术5年内手术失败率高达30%［2］。目前，抗代谢药如丝裂霉素C（mitomycin C，MMC）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU），仍是临床上最常用的抗术后滤过通道瘢痕化的药物。虽然MMC 和5-FU 有一定疗效，但它们所导致的角膜和结膜上皮损害、前房延迟形成、脉络膜损伤、滤过泡渗漏、术后感染等严重不良反应及并发症不容忽视。因此寻找安全有效的抗青光眼术后滤过通道瘢痕化的新药，一直是青光眼医师的研究热点。青蒿琥酯（artesunate，Art）是青蒿素的衍生物，随着对青蒿素及其衍生物研究的不断深入，发现其除传统的抗疟作用外，还具有抗瘢痕等作用［3］。本课题组前期研究证实，Art 能抑制体外培养的人Tenon 囊成纤维细胞（human tenon′s capsule fibroblasts，HTFs）的增生，诱导其凋亡［4］。自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并通过溶酶体降解的过程，以实现细胞自身的代谢需要和细胞器的更新，机体的生理和病理过程中都存在自噬。自噬可通过清除受损的细胞器对细胞存活起保护作用，而过度自噬将导致细胞程序性凋亡［5］，因此，自噬所起的作用是正面还是负面尚待研究。研究证实在淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌中，Art可以通过诱导肿瘤细胞自噬性死亡，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用［6-8］。本研究通过观察不同浓度Art 处理HTFs，利用分子生物学手段探讨Art 对HTFs 自噬的影响，从而为其在青光眼滤过性手术中的应用提供新的思路和线索。

1 材料与方法

1.1 材料来源 HTFs 购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。Art（中国桂林南药股份公司）；DMEM 培养基、胎牛血清（美国Hyclon 公司）；胰蛋白酶、二甲亚砜（美国Sigma 公司）；噻唑蓝（methyl thiazol tetrazolium，MTT）试剂盒（中国南京凯基生物有限公司）；ECL 显色试剂盒（美国Thermo 公司）；RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂（中国北京康为世纪生物科技有限公司）；逆转录定量PCR（quantitative reverse transcriptase PCR，qRT-PCR）检测试剂盒（美国ABI 公司）；兔抗人Beclin-1 抗体、β-actin 鼠抗人单克隆抗体、小鼠抗人微管相关蛋白1 轻链3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）-Ⅱ抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔及抗鼠IgG 二抗（中国碧云天生物技术研究所）；Cyto-ID®Green 自噬检测试剂盒（美国Enzo Life Sciences 公司）；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Invitrogen 公司）。

1.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基培养HTFs 细胞，置于5%二氧化碳37 ℃恒温培养箱中。及时换液，当细胞生长至培养基底的80% 时给予0.25%胰酶消化细胞传代处理。取3 ～6 代细胞用于本实验。

1.3 MTT 法检测HTFs 增殖 消化计数处于对数生长期的HTFs 细胞，接种于96 孔板，置于5%二氧化碳37 ℃恒温培养箱中培养24 h，实验分为空白对照组、Art 实验组（50，100，150，200 μg/mL）。空白对照组和Art 实验组HTFs 细胞分别加入到含10%胎牛血清的DMEM 培养基，Art 实验组按规定加入不同浓度（50，100，150，200 μg/mL）Art。再分别设置（24 和48 h）不同时间组。每组均铺3 复孔，置入培养箱中继续培养，同时观察量效和时效关系。每孔加入5 g/L 的MTT 20 μL，继续培养4 h，吸弃培养液，每孔加入150 μL 二甲亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解，采用酶标仪测定各孔于570 nm 波长下吸光度（A）值，取5 次测量的平均值。计算Art 对HTFs 的抑制率。生长抑制率=（1-处理组A/对照组A）×100%。

1.4 qRT-PCR 法检测HTFs 中LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表达 分组方法同上。加药48 h 后，PBS 缓冲液轻轻冲洗，反复两至三次，1 mL Trizol 轻轻吹打细胞，收集液体。根据RNA 提取试剂盒说明书提取总RNA。紫外分光光度仪测量RNA 浓度及纯度。按照qRT-PCR 试剂盒说明书进行逆转录。反应条件：42 ℃，60 min，70 ℃，5 min，4 ℃静置。β-actin为内参对照。引物序列设计：β-actin 上游引物：CCTGAGGCTCTTTTCCAGCC；下游引物：TAGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT。LC3-Ⅱ上游引物：GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG；下游引物：ACTCTCATACACCTCTGAGATTG。Beclin-1 上游引物：TGGATCACCCACTCTGTGAG；下游引物：TTATTGGCCAGAGCATGGAG。进行各组mRNA 的相对表达量的分析。

1.5 Western blot法检测HTFs中LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表达 空白对照组和Art 实验组处理方法同上。处理48 h 后，收集各组细胞，置冰上裂解并提取总蛋白，采用BCA 法进行蛋白定量。制备质量分数10% SDS 分离胶，取等量的上样蛋白加入SDS 凝胶中，电泳跑胶，电转印至PVDF 膜上，待脱脂奶粉液封闭漂洗后，加入相应一抗（小鼠抗人LC3-Ⅱ抗体、兔抗人Beclin-1 抗体，β-actin 鼠抗人单克隆抗体），4 ℃孵育过夜，次日漂洗后用山羊抗兔及抗鼠辣根过氧化物抗体37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL 显色，凝胶成像系统拍照，ImagJ 软件测量蛋白条带灰度值，以β-actin 作为内参，进行目的蛋白的相对含量分析。

1.6 Cyto-ID 染色法鉴定HTFs 自噬水平 选用150 μg/mL Art 处理的细胞作为实验组，空白对照组不加Art。实验组加入150 μg/mL Art 后，两组细胞继续培养48 h，用缓冲液漂洗2 次，加入适量染色试剂（自噬体染色剂Cyto-ID 与细胞核染色剂DAPI），置37℃培养箱内避光孵育20 min，弃多余的染料，用缓冲液清洗细胞3 次，在荧光显微镜下观察，Cyto-ID 染色阳性细胞即自噬细胞呈现绿色荧光，绿色荧光为核周围和细胞质的自噬小体及自噬溶酶体。随机选取200个细胞，计算Cyto-ID染色阳性细胞数，以Cyto-ID染色阳性细胞数所占的百分比来表示HTFs的自噬水平，重复3次，取平均值。

1.7 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，结果以均数±标准差表示，计量资料采用t检验，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度Art 对HTFs 增殖的影响 实验结果显示：24 h 和48 h 后，Art 实验组与空白对照组比较，细胞增殖均受到抑制，两组差异有统计学意义（均P＜0.05）。作用时间相同（24、48 h），随着Art 浓度增高，抑制率分别由4.7%增至59.1%，由13.3%增至68.6%。 Art 浓度相同（50，100，150，200 μg/mL），随作用时间增加，抑制率分别由4.7%增至13.3%，由8.7%增至31.4%，由36.2%增至50.0%，由59.1%增至68.6%。见表1。随着Art 浓度升高、作用时间延长，Art 对细胞抑制作用越明显，表现为浓度-效应及时间-效应依赖关系。

表1 Art 对HTFs 的细胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

表1 Art 对HTFs 的细胞抑制率Tab.1 The inhibition rate of fibroblasts growth by Art ±s

注：与空白对照组比较，aP ＜0.05，bP ＜0.01

分组空白对照组Art 实验组（μg/mL）50 100 150 200 24 h A 值0.127±0.002 0.121±0.004a 0.116±0.002b 0.081±0.003b 0.052±0.001b抑制率（%）－4.7±0.4 8.7±0.9 36.2±1.2 59.1±1.3 48 h A 值0.188±0.005 0.163±0.003b 0.129±0.002b 0.094±0.004b 0.059±0.002b抑制率（%）－13.3±0.6 31.4±1.1 50.0±1.0 68.6±1.3

2.2 不同浓度Art 对HTFs LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 表达的影响 qRT-PCR 检测结果显示：50、100、150、200 μg/mL Art 实验组LC3-Ⅱ和Beclin-1 mRNA 的相对表达水平较空白对照组均有明显升高，不同浓度Art 实验组LC3-ⅡmRNA 的相对表达量分别是空白对照组的（1.367±0.214）、（1.950±0.116）、（3.120±0.521）、（4.765 ± 0.371）倍；Beclin-1 mRNA 的相对表达量分别是空白对照组的（1.235 ± 0.164）、（1.746 ± 0.320）、（2.854 ± 0.244）、（3.487 ± 0.356）倍。各组间差异均有统计学意义（FL= 20.920，P＜0.01；FB= 26.370，P＜0.01）。总体上随着Art浓度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相对表达量均明显提高，呈现浓度依赖的关系，见图1。

图1 qRT-PCR 检测空白对照组与Art 实验组HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 的相对表达量Fig.1 LC3-Ⅱand beclin-l mRNA relative expression in control group and Art groups by qRT-PCR

2.3 不同浓度Art 对HTFs LC3-II 和Beclin-1 蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示：50、100、150、200 μg/mL Art 组LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白表达量较空白对照组均有明显升高，各组间差异均有统计学意义（FL= 32.852，P＜0.01；FB= 29.874，P＜0.01）。总体上随Art 浓度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 蛋白的表达量均明显提高，呈现浓度依赖的关系。见图2 及表2。

表2 Western blot 检测HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相对表达量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

表2 Western blot 检测HTFs 中LC3-II、Beclin-1 蛋白的相对表达量Tab.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups by Western Blot ±s

注：与空白对照组比较，aP ＜0.01

分组空白对照组Art 实验组（μg/mL）50 100 150 200 LC3-II 0.101±0.025 0.186±0.021a 0.302±0.082a 0.462±0.070a 0.808±0.102a Beclin-1 0.098±0.036 0.236±0.049a 0.441±0.101a 0.588±0.090a 0.784±0.064a

图2 空白对照组与Art 实验组HTFs 中LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白的表达Fig.2 LC3-Ⅱand beclin-l protein relative expression in control group and Art groups

2.4 Art 作用后HTFs 自噬水平的变化 选用150 μg/mL Art 处理的细胞作为实验组，不加Art 的细胞作为空白对照组。Cyto-ID染色结果显示：实验组HTFs 的核周和细胞质区呈现的绿色荧光较空白对照组明显浓聚，见图3。对照组和150 μg/mL Art 实验组的Cyto-ID 染色阳性细胞百分比分别为（13.302±2.301）%和（53.274±7.851）%，差异有统计学意义（t=8.804，P＜0.01）。

图3 荧光显微镜下观察HTFs 经Art 作用后自噬情况（×200）Fig.3 The autophagy activity of HTFs was evaluated by fluorescence microscope（×200）

3 讨论

细胞自噬是真核生物界一种普遍存在的生命现象，它具有重要的生理意义。正常情况下，自噬充当了垃圾处理和回收系统的功能，功能失常的自噬，可导致多种疾病的发生。研究显示，自噬参与了多种细胞功能的调控，并与癌症、衰老、创伤等多种疾病发生发展密切相关［9-11］。近年来研究发现自噬在抑制心肌、肺、肾脏等器官纤维化及疤痕的发生发展过程中发挥了重要作用［12-14］。研究证实肺纤维化以成纤维细胞过度增生、胶原蛋白过度沉积为特点，细胞自噬活化可以促进胶原的降解，抑制胶原的大量堆积［12］。KIM 等［14］研究表明诱导自噬能明显降低Ⅰ型胶原蛋白表达，降低肾纤维化。自噬与心肌纤维化的发生发展亦密不可分［15］。有研究发现心脏成纤维细胞受肾上腺素刺激继发细胞自噬，该反应可能减少病理条件下高肾上腺素对心脏成纤维细胞造成的有害影响如心肌纤维化［14］。增生性疤痕的发生可能与自噬不足有关，有研究发现在增生性疤痕组织自噬表达水平较正常组织明显降低［16］。有报道提示，自噬是伤口愈合过程中重要的“参与者”，可能参与了病理性瘢痕纤维过度增殖与胶原无序沉积的病理生理过程。成纤维细胞的自噬在伤口愈合过程中起一定的调节作用，能够减少细胞外基质中胶原蛋白的沉积，还可以通过调控细胞产生TGF-β和将“异常”细胞外基质排出细胞，减少瘢痕的产生［17-20］。以上研究为进一步探讨自噬与抗青光眼术后滤过通道瘢痕化的关系提供了有益的启示。前期研究证实，Art 能抑制HTFs 的增生，诱导其凋亡［4］，因此Art 在诱导HTFs 凋亡的同时，很可能对另一种细胞程序性死亡方式（自噬）也产生一定的影响。

LC3 是公认的自噬标志物，与酵母蛋白Atg8具有较高的相似性。LC3 具有2 种形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ存在一个生成-降解的动态过程。LC3 被具有蛋白内切酶活性的Atg4 在羧基端剪切，生成胞质LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ通过Atg7和Atg3 参与的泛素样反应，与自噬体双层膜上的磷脂酰乙醇胺结合，形成LC3-Ⅱ。在降解过程中，位于外膜的LC3-Ⅱ被半胱氨酸蛋白酶Atg4B 移除后回收，位于内膜的LC3-Ⅱ则被溶酶体降解。由于LC3-Ⅱ存在于自噬体膜上，其表达量与自噬体数量呈正相关。所以LC3-Ⅱ的表达量，可以作为一项衡量细胞内自噬活性的一个客观指标［21］。Beclin-1 基因是酵母自噬基因Atg6 的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。Beclin-1 与自噬前体的结合启动自噬体的形成。Beclin-1 也是自噬的正调控因子，其表达水平与自噬体的形成密切相关［22］。本实验通过检测LC3-Ⅱ、Beclin-1 的mRNA 和蛋白的表达来观察Art 对HTFs 自噬的影响。

本实验应用MTT 法检测不同浓度Art 作用24及48 h 对HTFs 的增殖抑制率，结果显示，Art 浓度越高、作用时间越长，对HTFs 增殖的抑制作用越明显，呈现浓度-效应和时间-效应依赖关系，其抑制率由4.7%增至68.6%。本研究应用qRT-PCR和Western Blot 检测LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的相对表达。qRT-PCR检测结果显示：Art作用48 h后，随着Art 浓度的增高，LC3-Ⅱ及Beclin-1 mRNA的相对表达量较空白对照组明显提高。Western Blot 检测结果显示：Art 作用48 h 后，随着Art 浓度的增加，LC3-Ⅱ和Beclin-1 蛋白的表达量较空白对照组亦明显提高。本实验表明Art 可以增加HTFs LC3-Ⅱ、Beclin-1 mRNA 和蛋白的表达，并且均具有浓度-效应依赖性，证实Art 可诱导HTFs 发生自噬。

综上所述，Art 可明显上调HTFs 自噬水平，诱导细胞发生自噬性死亡，抑制HTFs 增殖。关于自噬的激活和Art 抑制HTFs 的增生效应之间的关系及机制尚有待进一步研究，而在Art 处理后，凋亡与自噬在诱导HTFs 死亡过程中的相互作用方式尚需进一步研究。自噬性细胞死亡是Art 对HTFs增殖抑制的重要机制之一，为研究Art 的作用机制及Art 在临床上应用于抑制抗青光眼术后滤过通道瘢痕形成提供了新的思路。