小鼠胚胎培养在新建体外受精胚胎培养室质量控制中的作用

张花锦，王鸿周，周广义，张晨静，韩玉芬

(濮阳市妇幼保健院 生殖医学中心，河南 濮阳 457000)

我国近期调查结果显示，国内不孕症患者占已婚夫妇人数的10%左右，比1984年调查的4.8%增加一倍多，发病率呈上升趋势。体外受精—胚胎移植技术已成为一项针对不孕不育行之有效的人类辅助生殖技术，其中人类胚胎实验室则是生殖医学中心的关键，因为胚胎培养是不孕不育治疗环节中很重要的一环。高质高效的实验室环境对于胚胎的生长发育及胚胎实验室的成功率都起着非常重要的作用[1]。体内精卵结合及发育是在无菌无尘无味无毒避光的环境下发生的，而体外培养过程中配子、胚胎离开了母体稳定安全的环境，没有了母体的所有保护屏障，对体外整个培养体系发生的任何微小变化都会非常敏感，可能会降低胚胎的发育潜质，甚至发生遗传层面的基因突变。对于濮阳市妇幼保健院新建的胚胎培养实验室，胚胎培养实验室的环境温度和湿度、仪器设备的性能、试剂耗材的质量及实验室人员操作熟练程度等，是否能达到配子(精子和卵子)及胚胎体外操作和生长发育的要求相当关键[2]。

因此，在实验室启动人类胚胎培养前，为了保证精卵顺利结合及胚胎发育的培养稳定可靠，有必要对胚胎实验室整个培养体系进行质量控制。小鼠胚胎生物学检测已成为评估新建IVF 实验室最为常用的方法[3]。本院生殖医学中心于2019年2月底建成IVF 实验室，为了去除装修中及新购置的仪器设备产生的挥发性有机物(VOC)，经过通风处理4 个月后，先后两次对建筑材料以及实验室环境进行VOC 检测，结果均合格。2019年7月至2019年8月，在本中心人体外受精SOP 操作规范下，购置昆明小白鼠行体外体内受精进行胚胎实验室体外培养实验，以进行新建实验室的质量控制，提供可靠的实验数据和质量控制，从而保证本中心人类辅助生殖技术体外胚胎培养能顺利开展。体内受精—胚胎培养实验共10 批次，体外受精—胚胎培养实验共6 批次，其实验过程总结如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

昆明系小白鼠，雌鼠4～6 周龄，体重约25 g；雄鼠6～8 周龄，体重约30 g，均购自郑州大学实验动物中心[ 合格证号SCXK(沪)2017-0005]。在控光(日照约10h，8：00—18：00)、控温(23±2)℃，自由饮水摄食恒定环境下喂养5～7 d，适应后再用于实验。

1.2 药品与试剂

注射用孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)，购自宁波三生生物科技有限公司。采用瑞典Vitrolife 培养液系列：卵泡收集液G-MOPSPLUS、梯度法精子洗液SpermGrad、洗精受精液G-IVFPLUS、卵裂胚培养液G-1PLUS、囊胚培养液G-2PLUS、OVOIL-100 石蜡油等培养液均在使用前一天下午专用培养皿制作液滴后置于37℃，6% CO2培养箱过夜平衡。G-MOPSPLUS 置于37℃不通气培养箱过夜平衡。

1.3 耗材与设备

培养皿、巴斯德管、移液管、2099 离心管等均为美国Falcon 公司产品，均为一次性耗材。CO2气体纯度为99.999%，日本ASTEC 三气水套式培养箱四台(编号1、2、3、5)，日本ASTEC 抽屉式培养箱(编号6-1，6-2、6-3、6-4共四个抽屉)，美国Thermo 二氧化碳培养箱(编号7、8)。

1.4 小鼠超促排卵

将PMSG 和HCG 干粉均用专用稀释液配制成100IU/mL 溶液，适量分装保存于-20℃环境下。每只雌鼠17：00 腹腔内注射PMSG10IU，48 h 后再腹腔内注射HCG10IU[4-5]。

1.5 小鼠体内受精实验

分10 批次，每批次选6 只健康雌鼠，HCG 注射后1h 左右将雌雄小鼠以1∶2 比例合笼(为保证交配成功)，次日早上检查阴道栓，确认是否受精，如有阴栓则提示受精。20～22 h 后(次日15：00)雌鼠以颈椎脱臼法处死，实施酒精消毒背部无菌操作，取出输卵管，将收集的所有输卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，显微镜下找到输卵管膨大部(能隐约看到鼠胚细胞团)，用专用镊子解剖，轻轻刺破，可见小鼠卵子团释放出来，并将其收集到体外操作G-MOPSPLUS 皿中，透明质酸酶脱颗粒后将其放置于卵裂胚培养液G-1PLUS 液滴中，每个液滴最多放10 个卵，快速观察受精情况并记录受精率，然后置于37℃，6% CO2培养箱中培养。

1.6 小鼠体外受精实验

分6 批次，鼠精的收集：每批2 只健康雄鼠，取卵日实施颈椎脱臼法处死，酒精消毒小腹部，无菌操作取出附睾尾，于G-MOPSPLUS 中用专用眼科镊子从一端顺着一个方向向另一端轻轻挤压，多次反复，尽可能多地收集精液，一只使用密度梯度离心法处理精液，另一只使用上游法处理精液[6]。精液优化处理与收集方法来自本实验室依据黄国宁老师《辅助生殖实验室技术》新编写的标准操作规程。精子优化处理后G-IVF 液重悬装于2099 离心试管中，置于37℃，6% CO2培养箱中获能30 min 左右即可。

鼠卵收集：每批次选5 或6 只健康雌鼠，HCG 注射14 h 后实施颈椎脱臼法处死雌鼠，酒精消毒背部无菌操作取出输卵管，将收集的所有输卵管放置于G-MOPSPLUS 液滴里，解剖显微镜下找到输卵管膨大部(能隐约看到鼠胚细胞团)，用专用镊子，轻轻刺破，可见小鼠卵子团释放出来，并将其收集到体外操作G-MOPSPLUS 皿中冲洗3 次，并分别将其转移至G-IVF受精液滴中，每1 卵子团放1 个液滴中，放置于37℃，6%CO2培养箱中等待受精。

体外受精：显微镜下观察获能后的精子活力与浓度，取适量精子悬液加至待受精卵子细胞团的液滴中，使培养滴中精子浓度调到约5.0×106/mL，置于37℃，6%CO2培养箱中培养受精，4～6 h 后将卵子在G-1PLUS液清洗3 次后置于卵裂培养G-1PLUS 液滴中，观察受精情况并记录，于37℃，6% CO2培养箱中继续培养。

1.7 原核及卵裂期胚胎的观察与培养

D0：16：00 点左右观察第二极体和原核，记录受精情况，并将其转至已过夜平衡的卵裂培养液G-1PLUS中继续培养；D1：上午观察2 细胞并记录；D2：上午观察4 细胞期胚胎，下午观察8 细胞期胚胎，并将其转至已过夜平衡的囊胚培养液G-2PLUS 中继续培养；D3：上午观察桑椹胚并记录；D4：上午早期囊胚观察；D5～D6：上午囊胚观察并记录。

参考本中心SOP 统计实验数据，如受精率、卵裂率和囊胚形成率，其中受精率=受精数/获卵数；卵裂率=2C胚胎数/ 受精数；囊胚形成率= 囊胚数/8C 胚胎数。

1.8 数据分析

采用统计学软件SPSS 19.0 进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体内受精实验结果

本鼠胚实验共进行10 批次，共收集到1 478 枚卵，其中2PN 细胞1 378 枚，分别放入不同培养箱中培养。见表1。

表1 小鼠体内受精及不同培养箱胚胎培养统计

2.2 体外受精实验结果

本鼠胚实验共进行6 批次，共收集到721 枚卵，体外受精后获2PN 细胞665 枚，囊胚形成581 枚，囊胚形成率约为87.01%，培养结果见表2、表3；其中1～6 批次一部分小鼠精液洗涤处理采用上游法，另一半采用密度梯度离心法，密度梯度离心法处理精液后其受精率高于上游法，组间差异有统计学意义(P＜0.05)，组间卵裂率和囊胚形成率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表2 小鼠体外受精—上游法精液洗涤处理后胚胎培养统计

表3 小鼠体外受精—密度梯度离心法精液洗涤处理后胚胎培养统计

表4 小鼠体外受精—不同的精液洗涤处理方法对胚胎培养影响统计

2.3 抽屉式与非抽屉式培养箱培养小鼠胚胎发育结果比较统计

经分析，日本ASTEC 三气水套式培养箱(编号1、2、3、5)和美国Thermo 二氧化碳培养箱(编号7、8)培养结局比较无统计学意义，日本ASTEC 抽屉式培养箱(编号6-1，6-2、6-3、6-4 共四个抽屉)培养卵裂率为96.06%，与非抽屉式培养箱培养结局比较无统计学意义(χ2=0.799，P=0.371，P＞0.05)；囊胚形成率91.91%，明显高于非抽屉式培养箱，差异有统计学意义统计(χ2=6.034，P=0.014，P＜0.05)。见表5。

表5 抽屉式与非抽屉式培养箱培养小鼠胚胎发育结果比较统计

3 讨论

胚胎实验室是辅助生殖技术整个链条里的核心，这是辅助生殖技术与其他学科最大区别所在，建立稳定可靠的胚胎实验室，将有助于辅助生殖技术的成功。实验室在开展人类辅助生殖技术之前，必须检测其培养体系是否适合胚胎的培养，而鼠胚实验能够有效检测对胚胎有害的毒性环境，且有较高的敏感性。鼠胚实验的初始变量可以是配子、合子或者2 细胞胚胎，最终观察指标是囊胚形成情况[7-8]。因本中心是新建实验室，采取体内体外两种受精方式收集更多的实验数据来检测整个培养体系及胚胎实验人员的操作技能。

两组实验昆明系小鼠详细记录2- 细胞胚胎体外培养情况，在新建人体外受精培养室环境下，体内受精实验共进行了7 批次，共获卵1 478 枚，2PN 1 378 枚；体外受精实验共进行6 批次，共获卵721 枚，2PN 665 枚。体内体外两种受精方式受精率卵裂率囊胚形成率均达到胚胎实验室质量控制标准。说明鼠胚实验体内体外两种受精方式均能用于胚胎培养体系的质量控制与管理。体内受精组共收集到1 378 枚受精卵，形成2 细胞1 324枚，囊胚形成1 184 枚，囊胚形成率89.42%，结果证实实验室培养环境合格。同时将获得的鼠胚随机放入10 台培养箱中(实验室培养启动后用于人类胚胎培养)，统计所有培养箱中囊胚形成情况，结果显示，经过72 h 培养，所有培养箱能发育到囊胚期或孵化囊胚阶段的2 细胞胚胎达到80%以上，符合辅助生殖实验室质量控制标准[7-8]。其中抽屉培养箱囊胚形成率更高，抽屉式培养箱与其他非抽屉式培养箱相比，囊胚形成率比较差异有统计学意义(P＜0.05)，说明实验室所有培养箱都合乎培养要求，并且抽屉式培养箱更适合培养囊胚，从而指导实验室囊胚培养时首选抽屉式培养箱。而受精率与卵裂率差异比较无统计学意义(P＞0.05)。原因有三：(1)抽屉式培养箱为CO2、O2、N2三气同时供应，培养环境更稳定，更接近人体内胚胎发育环境要求。(2)抽屉式培养箱与非抽屉式培养箱相比，优化的腔体内部空间设计，大幅度提高了温度，CO2、O2、N2三气的恢复速度，以保证胚胎培养环境稳定。(3)抽屉式培养箱气体比例更精准化，更利于囊胚培养。有研究证明[9]，低比例氧气含量的大气环境可以提高囊胚的形成率。本次实验不仅加强和提高了胚胎实验室人员操作熟练程度，更规范和改善了实验技术能力，在以后工作中，囊胚培养尽量选择抽屉式培养箱培养法则。

上游法与密度梯度离心法是目前辅助生殖技术精液处理最常用的精子优化方法。有实验研究表明[10]研究表明，密度梯度离心法精子回收率及精子质量高于上游法。本实验结果显示，两组使用密度梯度离心法和上游法处理精液后所获得的受精率比较，差异有统计学意义，密度梯度离心法获得的受精结局明显优于直接上游法。原因分析可能为以下三点：(1)与精子上游法相比，密度梯度离心法能更好地分离精子和非细胞及碎片，从而回收更多形态正常的精子，并且明显增加精子的活力和体外生存能力[11]。(2)密度梯度离心法处理精子时，活力好及形态正常的精子回收率高，从而提高精卵结合的可能性。(3)上游法处理精子，需要精液与培养液共同放在培养箱孵育1h，时间较长。研究表明[12]上游法处理精子会增加精子代谢产物活性氧的生成，造成精子氧化损伤，从而影响精卵结合能力。实验中也发现，上游法处理精子，每一条活动精子不可能都会发生上游，活动精子回收率不能保证，有时操作过程中上游液与底部精液分界面分辨不清，回收精子中不动精子增多，卵细胞受精时活动精子浓度较低，不能达到本实验室SOP 要求(活动精子浓度不小于5.0×106/mL)，从而降低精卵结合的机会。

综上所述，辅助生殖技术过程中，精液优化推荐采用密度梯度离心法，特别是针对精液活力及浓度分析质量比较差的人群。两种精液处理方法对卵裂率和囊胚形成率无显著影响，原因可能是卵细胞精卵结合时的选择也是优胜劣汰，优选的精子更有可能与卵细胞结合，两种方法产生的胚胎发育环境是一致的，精液优化处理方法对胚胎发育影响可能比较小，差异无统计学意义，同时也证实了整个胚胎培养体系、培养环境及胚胎师操作技能已经达到质控要求。

胚胎实验室质量控制一直是胚胎学家工作的重点。但是，配子收集、受精以及胚胎培养等过程复杂，影响因素众多，因此也是难点。鼠胚实验已成为评估新建辅助生殖胚胎实验室最为常用的方法，黄国宁老师的《辅助生殖实验室技术》也曾提到，鼠胚实验是检测培养体系是否合格，更是规范整个胚胎培养体系，标准化培养过程，更接近体内环境下胚胎发育过程。整个鼠胚实验，在胚胎实验室标准操作规程严格执行前提下，使得实验人员的操作技术以及操作熟练度得到了很大的完善和提高。实验中收集的数据均已达标，给我们以后开展工作增强了信心。但必须明确一点，鼠胚培养结果不能完全反映人类胚胎的安全性，没有任何一种方法可以配子、胚胎的发育及存活的检测试验，但这些实验可以检测对胚胎有害的毒性环境[1]。可见，鼠胚实验依旧是一个需要不断改进的胚胎生物检测系统，也督促实验室人员在以后工作中完善实验数据完整收集与整理，做好实验室数据质控，形成持续性胚胎实验室质量控制模式，发现问题，分析问题，保证后期结果的稳定性。