Cyclin D1、PSTAT3和OPN蛋白在胰腺导管腺癌中的表达及临床意义

刘燕 张曼 李成龙

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocacinoma，PDAC）是一种主要来源于胰腺导管上皮的恶性肿瘤，恶性程度极高［1］。信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）家族的重要成员，其在Tyr705 位点被激活后可形 成PSTAT3（phosphorylated STAT3）［2］。研 究发现，活化的STAT3 能促使细胞发生恶性转化，在裸鼠中形成肿瘤，因而STAT3被认为是一种癌基因［3］。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）是STAT3信号转导途径下游的一个靶基因，其异常表达可对细胞周期循环产生影响。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）作为一种转移相关蛋白，在肿瘤发生及转移中发挥重要作用。本研究检测Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC患者中的表达情况，探讨其在PDAC 中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年3月至2017年3月本院收治的75例PDAC 患者作为研究对象（PDAC 组）。其中男45 例，女30 例，平均年龄（49.19±2.14）岁，临床分期：Ⅰ期23 例，Ⅱ期20 例，Ⅲ期19 例，Ⅳ期13 例。组织病理学分级：高分化腺癌（Gl 级）23 例，中分化腺癌（G2 级）30 例，低分化腺癌（G3 级）22 例。纳入标准：①所有患者有明确的病理学诊断依据，均确诊为PDAC［4］；②入组前未接受放疗及化疗；③肿瘤直径≤5 cm；④临床资料完整无缺失；排除标准：①合并血液疾病者；②严重精神疾患或痴呆等无法配合本研究者；③存在除胰腺癌以外其他原发性恶性肿瘤者；④合并风湿免疫及结缔组织病变者。另外取30 例来自切取供肝时附带的正常胰腺组织及相应临床资料作为对照组，男19 例，女11 例；平均年龄（48.26±2.01）岁；两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，受试者或家属均签署知情同意书。

1.2 研究方法

收集所有患者临床资料，比较Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 组织及正常胰腺组织中的表达；分析Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 患者各病理参数的相关性，记录所有患者在随访时间内存活及死亡情况。

1.3 检测方法

1.3.1 主要试剂

兔抗人多克隆抗体phospho-STAT3（Tyr705）为美国Upstate 公司产品，鼠抗人单抗Cyclin D1（DCS-6）购自丹麦的DAKO 公司，鼠抗人单抗OPN 为美国Santa Cruz 公司产品。操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 结果判定［5］

判断Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白阳性范围的标准：每张切片在镜下分别以低倍镜及高倍镜进行观察，对每张切片上中下及里外中9 个位置观察，根据Wachters 等的标准分析免疫组化。PSTAT3 阳性染色定位于细胞核上，Cyclin D1、OPN 阳性染色定位于胞浆和胞膜上。采用Volm双评分法进行判定，在染色均匀的肿瘤区，选取5个高倍镜视野（×400）：按阳性细胞百分率（A 值）评分：＜25%为1 分，25%～50%为2 分，＞50%为3分；按染色强度（B 值）评分：不着色为0 分，浅棕黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。综合染色阳性细胞数与染色强度判断结果：阴性（-）：0 分，弱阳性（+）：1～2 分，中度阳性（++）：3～4 分，强阳性（+++）：5～6 分；两种计分的乘积为每例的加权分数，加权分数为0 为阴性，其余均为阳性。

1.4 随访方法

随访从患者术后开始，直至患者死亡或本研究的随访结束，为期3年，截止于2020年3月31日。患者的随访时间分布在10 至36 个月，平均随访时间为（29.67±3.11）个月。对患者随访的方式主要采用患者来院复查为主。总生存时间（Overall Survival，OS）表示患者从手术至死亡的时长。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；计量资料采用（）表示；采用多元Logistic 回归分析影响PDAC 患者预后生存的危险因素，绘制Kaplan-Meier 生存曲线研究Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白对患者预后生存的影响；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 组织及正常胰腺组织中的表达

PDAC 组Cyclin D1、PSTAT3 和OPN蛋白阳性率高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1。

表1 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白在PDAC 组织及正常胰腺组织中的表达比较［n（%）］Table 1 Expression comparison of cyclin D1，PSTAT3 and OPN proteins in PDAC tissues and normal pancreatic tissues［n（%）］

图1 Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白免疫组化染色图（SP，×500）Figure 1 Immunohistochemical staining of Cyclin D1，PSTAT3 and OPN protein（SP，×500）

2.2 不同临床病理特征患者Cyclin D1、PSTAT3和OPN 蛋白的表达比较

临床分期Ⅲ+Ⅳ、有淋巴转移及神经浸润的患者Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白阳性率表达显著更高（P＜0.05）。见表2。

表2 不同临床病理特征患者Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白的表达比较［n（%）］Table 2 Expression of cyclin D1，PSTAT3 and OPN in patients with different clinicopathological features［n（%）］

2.3 影响PDAC 患者预后生存的危险因素

随访结果显示，75 例患者3年生存率为13.33%（10/75）。神经浸润、淋巴转移、Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白阳性是影响PDAC 患者预后生存的独立危险因素（P＜0.05）。见表3。

2.4 Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白对PDAC 患者预后生存的影响

Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白阴性组平均生存时间均长于Cyclin D1、PSTAT3 及OPN 蛋白阳性组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 不同Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白表达患者预后生存情况Figure 2 Prognosis and survival of patients with different expression of cyclin D1，PSTAT3 and OPN

3 讨论

既往研究显示，STAT3 在多种人类恶性肿瘤组织及细胞系中存在高表达，而在正常组织中表达比较微弱，提示STAT3 信号传导途径的激活在肿瘤的发生过程中起到重要的作用［6］。本研究结果显示，PDAC 患者中PSTAT3 蛋白呈显著阳性表达，且在临床分期越高、出现淋巴结转移及神经浸润患者中阳性表达率更高，表明PSTAT3 蛋白可参与PDAC 的发生发展，这与黄陈等［7］研究中免疫组化发现PSTAT3 在胰腺癌组织中存在高表达，与临床分期及淋巴结转移有关相符合。

目前，CydinD1已被证实是STAT3 信号转导途径下游的一个靶基因［8］。诸多研究证实，CyclinD1 参与多种实体瘤形成的分子病理过程［9-10］。Kanayama 等［11］应用免疫组织化学的方法检测显示CycliID1 蛋白在胰腺癌细胞核中呈阳性表达，而其在正常组织中均为阴性表达，并且其表达情况与患者生存率有关。何劲松［12］等研究证实CydinD1在胰腺癌组织标本中呈过度表达。孟沙等［13］研究提出：当cyclin D1 过表达时，会使细胞失去对生长因子的依赖，产生大量的激酶复合体，诱导Rb 磷酸化，最终释放转录因子E2F，导致细胞增殖加速，在此过程中则易引发细胞癌变。本研究中，CyclinD1 阳性染色定位于细胞的细胞核内，在癌组织中的阳性表达率显著升高，与何劲松等研究数据趋势一致，且本结果中CydinD1在病情严重患者中阳性表达率更高，其发展趋势符合孟沙的研究理论。

OPN 广泛分布于人体内多种组织和细胞中，是一种具有组织细胞特异性的的分泌型磷酸化糖蛋白。国外学者认为，OPN 在多种恶性肿瘤组织中高表达，其参与多种恶性肿瘤的发生发展、侵袭和转移过程，并在一定程度上反映肿瘤细胞的恶性程度［14-15］。关于OPN 参与PDAC 侵袭转移的具体机制目前尚未明确。本组关于OPN 蛋白在PDCA 及不同病理特征患者间中的表达符合国外学者提出的研究理论，且与唐雨等［16］研究中OPN 在胰腺癌组织中过表达的结果一致。本文经进一步Logistic 回归分析及Keplan-meier 生存曲线分析，结果显示：CydinD1、pTAT3 及OPN 蛋白阳性表达是影响患者预后生存的独立危险因素，阳性表达患者生存时间均显著缩短，提示三者可作为评估患者预后的指标。

综上所述，Cyclin D1、PSTAT3 和OPN 蛋白的高表达与PDAC 病情进展及预后有着密切关系，可作为预测患者预后生存的分子标志物和肿瘤治疗的潜在的靶点。